Vorremmo ringraziare il ERP Stiftung, in Triesen Liechtenstein, per sostenere finanziariamente la nostra ricerca sullo stress ossidativo.

Studi sul test della cometa eseguite presso l&#39;Università di Basilea, Dipartimento di Oftalmologia sono stati approvati dal Comitato Etico Locale di Basilea 1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare Dulbecco tampone fosfato (PBS) (Ca ++, Mg ++ libero) soluzione aggiungendo PBS (1 L confezione) e 990 ml di dH 2 O ai media. Regolare il pH a 7,4. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare la soluzione di lisi: Per preparare 1.000 ml aggiungono 2,5 M NaCl (146,1 g), EDTA 100 mm (37,2 g) e 10 Trizma mm base (1,2 g) in dH 2 O. </li><li> Preparare buffer per elettroforesi (NaOH 300 mm / 1 mM EDTA) con l&#39;aggiunta di 30 ml di NaOH 10 M e 7,5 ml di 0,2 M EDTA, qb a 1500 ml dH 2 O e mescolare bene. Il volume totale dipende dalla capacità di dialogo gel. Prima dell&#39;uso, misurare il pH del tampone per assicurare un pH&gt; 13. </li><li> Preparare tampone neutralizzazione contenente 0,4 M Tris (48.5 gm aggiunto a ~ 800 ml dH 2 O, aggiustare il pH a 7,5), concentrato (&amp; #62; 10 M HCl) a 1000 ml con dH 2 O. Conservare la soluzione a temperatura ambiente. </li><li> Preparare soluzione colorante. Per etidio bromuro (EtBr, 10x Archivio, 20 mg / ml) aggiungere 10 mg di EtBr in 50 ml di dH 2 O e conservare a temperatura ambiente. Per 1x Archivio - mescolare 1 ml con 9 ml dH 2 O. PRUDENTE! Maneggiare EtBr con adeguata cautela in quanto è un noto cancerogeno. </li></ol> 2. Isolamento dei leucociti <ol><li> Ottenere campioni umani di sangue (20 ml) con anticoagulante come l&#39;eparina mediante puntura venosa. </li><li> Separare i linfociti utilizzando un separatore cellulare gradiente di densità come Histopaque. <ol><li> Brevemente, diluire il sangue in rapporto 1: 1 con PBS o RPMI (senza FBS) e lo strato di oltre 600 microlitri separatore cellulare liquido. </li><li> Centrifugare 1.800 xg per 20 min a 4 ° C. Aspirare il coat &#39;buffy&#39; in 3-5 ml di PBS / RPMI e centrifugato a 300 xg per 10 minuti per ottenere il pellet linfociti. </li><li> Recuperare i linfociti da appena sopra confine tra PBS (RPMI) E separatore cellulare liquido, con una pipetta. Rimuovere le bande leucociti dall&#39;interfaccia tra il plasma e il separatore di cella strati liquidi di ciascun tubo e raccogliere in una provetta da 50 ml. </li></ol></li><li> Portare il volume totale di 50 ml con il freddo di Dulbecco modificato (DMEM). Lavare la sospensione cellulare tre volte con DMEM a 300 xg per 10 min. </li><li> Contare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro. Sospendere le cellule in PBS e aliquote in provette da microcentrifuga a 10 7 cellule / tubo. </li><li> Pipettare 0,4 ml di cellule in 5 ml di plastica tubo usa e getta. Aggiungere 1,2 ml di 1% a bassa temperatura di gelificazione agarosio a 40 ° C. Mescolare e rapidamente e pipettare 1,2 ml di sospensione cellulare sulla superficie agarosio-coperto di un vetrino pre-rivestite. Evitare la produzione di bollicine. </li><li> Lasciare che il agarosio di gel per circa 2 minuti. Essere coerenti con il tempo e la temperatura utilizzata per la gelificazione, e garantire che agarosio sia completamente impostata prima di immergere in soluzione di lisi. Dopo completamente set, immergere in soluzione lisante a ~ 4 ° C. </li></ol> 3. Lysis e elettroforesi NOTA: La procedura descritta è per elettroforesi in condizioni di pH&gt; 13 alcaline. <ol><li> Dopo almeno 2 ore a ~ 4 ° C, rimuovere delicatamente i vetrini dalla soluzione di lisi. Collocare i vetrini affiancati sulla scatola gel orizzontale vicino ad una estremità, scorrevole come vicino possibile. </li><li> Riempire i serbatoi tampone con appena fatto tampone pH&gt; 13 elettroforesi fino a quando il livello del liquido copra completamente le diapositive (evitare bolle sul agarosio). </li><li> Lasciare diapositive sedersi in tampone alcalino per 20 min per consentire lo svolgimento del DNA e l&#39;espressione di danni alcali-labili. </li><li> Attivare alimentazione a 25 volt (~ 0,75 V / cm) e regolare la corrente a 300 milliampere alzando o abbassando il livello del buffer. Elettroforesi i vetrini per 30 min. </li><li> Spegnere l&#39;alimentazione. Sollevare delicatamente le diapositive dal buffer e ppizzo su un vassoio di scarico. Eliminare cappotto saggio i vetrini con la neutralizzazione Buffer. Lasciare i vetrini a sedere per almeno 5 minuti. Scolare diapositive e ripetere altre due volte. </li><li> Colorare i vetrini con 80 microlitri 1x etidio bromuro (EtBr) e lasciar riposare per 5 minuti e poi immergere in acqua distillata fredda per eliminare l&#39;eccesso macchia. Poi posto un vetrino sul vetrino e archiviare immediatamente. Conservare i vetrini per un mese a temperatura ambiente in condizioni di asciutto. NOTA: Altri macchie DNA (ad esempio, SYBR-verde) può essere utilizzato anche. Attenzione! indossare guanti di protezione, come la maggior parte delle tinture sono mutageni. </li></ol> 4. Quantificazione delle rotture del DNA <ol><li> Per visualizzare il danno al DNA, di osservare il vetrino DNA EtBr macchiato con un microscopio a fluorescenza obiettivo 40X. </li><li> Valutare danni DNA quantitativamente nelle cellule misurando la lunghezza di migrazione del DNA e la percentuale di DNA migrato (Figura 1A). Quantificare il danno al DNA (Figura 1B) dal momento in cui parti apribili e Olive-Moment. Definizioni di Tail-Moment e Olive -Moment sono stati precedentemente data 8-10. NOTA: Nella nostra esperienza è abbastanza per attaccare da uno dei parametri. Le cellule sono fotografati impostando lo strumento automatico che analizza sulle celle vetrino da microscopio e fotografie. Quantificazione delle rotture del DNA può essere effettuata da pacchetti software di analisi delle immagini. Ci sono diversi pacchetti software differenti che sono realizzati su misura per catturare l&#39;immagine delle cellule e quantificare il danno al DNA. Si consiglia di utilizzare lo stesso pacchetto software tutto l&#39;esperimento. Il tecnico di laboratorio identifica la cellula intatta o una cometa da valutare sul computer e fa clic con il mouse su di esso. La cella cometa o intatto viene segnato automaticamente. </li></ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Phillips, J. L., Singh, N. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage:+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group.">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li><li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station.">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li><li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes.">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li></ol>

Scienziati svedesi Ostling e Johanson sono stati i primi nel loro campo di utilizzare test della cometa per quantificare i danni del DNA nelle cellule 1. Le condizioni neutre che i due scienziati hanno usato, tuttavia, solo permesso la rilevazione di doppio filamento rotture del DNA. Singh et al. In seguito adattato il test per l&#39;uso in ambiente alcalino, che ha prodotto una versione sensibile che potrebbe valutare doppie e singole filamento rotture del DNA e di rilevare i siti alcali-labili 12. Dal suo sviluppo iniziale, il test è stato modificato in varie fasi per renderlo adatto per valutare i tipi di danno al DNA in diversi tipi cellulari 13-15. Come per tutte le tecniche, prestando una rigorosa attenzione ai dettagli tecnici è importante per ottenere risultati accurati 16. Sulla base della nostra esperienza, i migliori risultati si ottengono se ogni passo da metodologico preparazione soluzione cometa quantificazione-viene eseguita da esperti tecn laboratorioicians. L&#39;utilizzo di mezzi freschi e correttamente preparato, adeguate tecniche di pipettatura, esatta tempistica e (come precedentemente menzionato nella sezione risultati) l&#39;uso di leucociti preparati al momento sono essenziali per lisi e elettroforesi su gel di ottenere risultati accurati 17. Tutte le singole fasi di questo saggio sono ugualmente importanti per ottenere risultati affidabili. 16 In generale i migliori risultati si ottengono se ogni singolo passo metodologico dalla preparazione soluzione fino quantificazione cometa viene eseguita da esperti del laboratorio technicians.Important sembrano l&#39;uso di mezzi freschi e correttamente preparati , adeguate tecniche di pipettatura, i tempi esatti e, come già di cui nella sezione dei risultati l&#39;uso di leucociti preparati al momento per lisi e gel elettroforesi per ottenere risultati adeguati dal saggio 17. Come fare altre metodologie, la tecnica comet assay ha il suo advanTages e svantaggi. Essendo un metodo sensibile, il saggio è vulnerabile a fattori (ad esempio, raggi UV) che possono aumentare la rotture del DNA e quindi influenzare i risultati. Qualsiasi fattore che può aumentare lo stress ossidativo, ad eccezione di ciò che è oggetto di ricerca, dovrebbe essere evitato. Stress possono aumentare il livello di stress ossidativo non solo nei leucociti, ma anche in tutti gli altri mezzi di sangue e linfociti. Come detto in precedenza ci sono molti modi diversi e più dirette di misurare lo stress ossidativo 18,19. Il saggio comet è uno dei molti metodi che ha alcuni vantaggi. Questi includono il suo costo relativamente basso, il piccolo numero di celle richieste (&lt;10.000 cellule) e quindi i piccoli campioni di sangue necessaria per paziente, il periodo relativamente breve di tempo necessario per quantificare il danno del DNA in cellule (circa 3 giorni), la sua sensibilità e la sua diffusa applicabilità ai danni asini DNA in diversi tipi di cellule. In passato abbiamo scegliere di lavorare con leucociti da quando abbiamo avuto esperienza con questotipo cellulare ed era applicabile per un particolare studio previsto. Un altro vantaggio del comet assay è che può essere utilizzato per rilevare diversi tipi e livelli di danno al DNA e quindi può essere applicata in vari altri settori di studi oltre stress ossidativo quali studi di riparazione del DNA, trattamenti per il supporto o genotossicità. Lo stress ossidativo è ora riconosciuto come giocare un ruolo fondamentale nella patogenesi di diverse malattie. Il metodo comet assay, mentre uno dei molti modi per misurare lo stress ossidativo 18,19, è relativamente semplice, versatile e poco costoso. Quando masterizzato, questo metodo può essere utilizzato in tutti i settori della medicina in cui lo stress ossidativo svolge un ruolo significativo 8-10,20,21.

Comet assay è stato sviluppato da scienziati svedesi Ostling e Johanson 1. DNA è una molecola carica negativa. Durante l&#39;elettroforesi, più piccole, i frammenti di DNA danneggiato viaggiano più velocemente verso un anodo caricato positivamente 2. Più i frammenti di DNA, più veloce la loro migrazione verso l&#39;anodo a formare un tipico &quot;comet&quot; con una &quot;testa&quot; composta intatta, DNA integro e una &quot;coda&quot; composto di frammenti di DNA danneggiati 3. DNA danneggiato può essere riparato da diversi meccanismi nel corpo 4, che mantengono la generazione di rotture del DNA abbastanza equilibrati 5. Se, tuttavia, il saldo è a favore di rotture del DNA, le interruzioni possono accumularsi e finiranno contribuire allo sviluppo di una malattia. Il nostro DNA subisce circa 0.000165% di danni in un determinato momento 6. Singole rotture del DNA bloccati si riferiscono ad un difetto su uno dei due filamenti del DNA a doppia elicaconsiderando double-stranded rotture del DNA sono causati quando entrambi i filamenti della doppia elica del DNA sono danneggiati. Ci sono vari fattori che possono aumentare la quantità di rotture del DNA in un dato momento, quali l&#39;età della cellula, fumo di sigaretta, vari farmaci o stress ossidativo 7-9. Se tutti i fattori che portano a rotture del DNA avanzati sono mantenute costanti, quindi la quantificazione di rotture del DNA per mezzo di test della cometa è un buon parametro indiretto dello stress ossidativo. Il metodo di test della cometa è utilizzata sempre più oggi in medicina tra cui oftalmologia. Una ragione di ciò è che lo stress ossidativo è sempre più riconosciuto come un meccanismo patogenetico per varie malattie 8-11 e comet assay è un metodo con cui lo stress ossidativo può indirettamente essere quantificato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>(CPW59)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM1370)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(E-8751)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(1077-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(TS1006)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Ranbaxy Rankem</td>
			<td>(S0160)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>BDH-Merck</td>
			<td>(89021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM 845)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Spectrochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials required for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Melting Agarose (NMA)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM273)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(A9414)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol - Qualigens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>(500010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor and Tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

Organismi eucarioti superiori non possono vivere senza ossigeno; tuttavia, paradossalmente, l&#39;ossigeno può essere dannoso per loro. La molecola di ossigeno è chimicamente inerte, relativamente perché ha due elettroni spaiati situati in diverse pi * orbitali anti-incollaggio. Questi due elettroni hanno spin paralleli, nel senso che ruotano nello stesso verso attorno al proprio asse. Per questo motivo la molecola di ossigeno non è molto reattivo. Attivazione di ossigeno può avvenire per due meccanismi differenti; sia attraverso la riduzione con un elettrone alla volta (riduzione monovalente), oppure attraverso l&#39;assorbimento di energia sufficiente per invertire la rotazione di uno degli elettroni spaiati. Il risultato è la produzione di specie reattive ossidative (ROS). Ci sono un certo numero di modi in cui il corpo umano elimina ROS nel suo stato fisiologico. Se la produzione di ROS supera la capacità di riparazione, i risultati dello stress ossidativo e danni molecole diverse. Ci sono molti metodi diversi con cui lo stress ossidativo può essere measured. Questo manoscritto concentra su uno dei metodi denominati gel elettroforesi cellulare, noto anche come &quot;comet assay&quot;, che consente la misurazione di rotture del DNA. Se tutti i fattori che causano danni al DNA, diverso da stress ossidativo sono mantenute costanti, la quantità di danno al DNA determinato tramite test cometa è un buon parametro di stress ossidativo. Il principio è semplice e si basa sul fatto che le molecole di DNA sono caricate negativamente. Una molecola di DNA intatto ha una grande dimensione tale da non migra durante l&#39;elettroforesi. Rotture del DNA, tuttavia, se presente risultato in frammenti più piccoli che si muovono nel campo elettrico verso l&#39;anodo. Frammenti più piccoli migrano più velocemente. Poiché i frammenti hanno dimensioni diverse il risultato finale della elettroforesi non è una linea distinta ma piuttosto un continuum con la forma di una cometa. Il sistema consente di quantificare il &quot;comet&quot; risultante e quindi delle rotture del DNA nella cellula.

Sebbene il metodo di test della cometa rende risultati riproducibili, può essere influenzata da una varietà di fattori. Uno di questi fattori è o meno i leucociti vengono crioconservati prima lisi e gel-elettroforesi o se questa operazione viene eseguita su leucociti appena preparati. La Figura 2 mostra che nel gruppo 2, dove sono stati crioconservati prima lisi e l&#39;elettroforesi su gel ss- DNA leucociti pause erano significativamente più alti, rispetto al gruppo 1 dove lisi e gel -Elettroforesi è stato fatto su cellule preparate al momento. Il dosaggio può anche essere utilizzato per valutare indirettamente stress ossidativo sistemico. La tabella 1 mostra le statistiche descrittive per fanalino posteriore momento e Olive- momento in fumatori e soggetti sani. I dati rivelano che il fumo mezzo pacchetto di sigarette al giorno raddoppia pause ssDNA nei leucociti circolanti 9. <img alt="Figura 1A" src= &quot;/ Files / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="Figura 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> Figura 1. (A) raffigura il microscopio utilizzato durante l&#39;analisi del test della cometa. (B) Δ raffigura una tipica &quot;cometa&quot; con una testa brillante e la coda (danneggiato frammenti di DNA più piccoli). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> Figura 2. pause ssDNA erano significativamente più alti quando i leucociti sono stati crioconservati (Gruppo 2) rispetto a quando leucociti preparati al momento sono stati utilizzati prima di lisi e gel elettroforesi. <imgalt = &quot;tabella 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; Tabella 1. I fumatori avevano più del doppio del numero di interruzioni ssDNA rispetto a età e sesso abbinato non fumatori sani.

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Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet assay misura rotture del DNA, indotte da fattori diversi. Se tutti i fattori (ad eccezione di stress ossidativo) che causano danni al DNA sono mantenute costanti, la quantità di danni al DNA è un buon parametro indiretto dello stress ossidativo. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare comet assay per la misura indiretta di stress ossidativo.

Comet Assay come una misura indiretta della sistemica Stress ossidativo

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.1K Views.  University of Basel.  Comet assay misura rotture del DNA, indotte da fattori diversi. Se tutti i fattori (ad eccezione di stress ossidativo) che causano danni al DNA sono mantenute costanti, la quantità di danni al DNA è un buon parametro indiretto dello stress ossidativo. L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare comet assay per la misura indiretta di stress ossidativo. 

Video: Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Ricerca

Biologia

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

Applicazione di un<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Protection Assay per visualizzare stress Mediazione Proprietà del Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Metodo per la valutazione degli effetti di un intervallo di lunghezze d&#39;onda e intensità di / vicino-infrarosso di terapia della luce rossa sullo stress ossidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

Misura Stress ossidativo Resistenza<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96 pozzetti micropiastre

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

In vitro misurare phosphatidylethanolamine metiltransferasi attività

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In Vivo alcalina Comet Assay e l&#39;enzima modificato alcalina Comet Assay per la misurazione rotture del DNA Strand e danno ossidativo del DNA in fegato di ratto

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

Metodi per classificare i foci citoplasmatici come granuli di stress di mammiferi

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

Un test di competizione di piatto come una rapida valutazione preliminare di soppressione di malattia

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Escrescenza glomerare come un'analisi di Ex Vivo per analizzare i percorsi coinvolti nell'attivazione delle cellule epiteliali Parietali

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...