Questo protocollo descrive alcuni metodi per quantificare la formazione di goccioline lipidiche negli organoidi intestinali umani. Può essere utilizzato come piattaforma di screening ad alta produttività per testare i farmaci che modulano la formazione di goccioline lipidiche. Il metodo che descriviamo si basa su un colorante specifico per goccioline lipidiche e organoidi intestinali derivati dalla biopsia.
Fornisce così un modello stabile, accurato e fisiologicamente rilevante per la formazione di goccioline lipidiche. Questo protocollo può essere utilizzato per lo schermo per i nuovi candidati ai farmaci specifici del paziente che modulano la formazione di goccioline lipidiche, ad esempio, in pazienti carenti di DGAT1. Questo saggio di formazione di goccioline lipidiche può anche essere applicato ad altri tipi di colture organoidi per studiare il metabolismo lipidico in altri tipi di cellule.
Il saggio dipende in larga misura dalla densità della coltura organoide. Cerca di garantire una densità organoide costante tra campioni ed esperimenti. La dimostrazione visiva di questo saggio è fondamentale perché è importante mostrare come l'organoide dovrebbe essere coltivato e come dovrebbe essere gestito per garantire una corretta analisi della formazione di goccioline lipidiche.
Dopo aver preparato gli organoidi, aspirare attentamente il mezzo di coltura senza disturbare le goccioline della matrice della membrana basale. Aggiungere 500 microlitri di mezzo basale freddo al primo pozzo di organoidi. Utilizzando una pipetta P1000, pipettare delicatamente su e giù per interrompere le goccioline a matrice di membrana sotterranea con organoidi.
Ripetere queste procedure con lo stesso mezzo nel prossimo e richiesto, ma non raccogliere più di due pozzi per 500 microlitri di mezzo basale. Raccogliere gli organoidi in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri a bassa legatura e farli girare verso il basso in una mini centrifuga da tavolo per 15-20 secondi. Aggiungere 400 microlitri di triptina agli organoidi spun-down.
Incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, utilizzare una pipetta P200 per pipettare delicatamente la sospensione su e giù per interrompere gli aggregati rimanenti di celle. Incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Quando rimangono solo singole cellule, aggiungere un millilitro di mezzo basale e far girare le cellule in una mini centrifuga da tavolo per 15-20 secondi. Aspirare completamente il supernatante. Utilizzare una pipetta P200 per sospendere di nuovo le singole celle in 200 microlitri di hSI-EM fresco e aggiungere altri 800 microlitri di hSI-EM.
Quindi contare il numero di celle in sospensione e calcolare il volume di celle necessarie per la densità cellulare finale. Esettare il volume appropriato di sospensione e regolare la densità a 750 celle per microlitro. Aggiungere la matrice della membrana basale alla sospensione cellulare in un rapporto di due a uno.
Pipettare delicatamente la sospensione per mescolare facendo attenzione a evitare di creare bolle. In una piastra di coltura pre-riscaldata, seminare tre goccioline da 10 microliter per pozzo se la piastra ha 24 pozzetti o una goccia a cinque microliter per pozzo se la piastra ha 96 pozzi. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica per 10-15 minuti per solidificare le goccioline.
Nel frattempo, pre-riscaldare un volume appropriato di hSI-EM +Y in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Dopodiché, aggiungere con cura l'hSI-EM+Y pre-riscaldato ad ogni pozza della piastra. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il cinque per cento di anidride carbonica.
Dopo due o tre giorni, sostituire il supporto con hSI-EM e assicurarsi di aggiornarlo da due a tre volte a settimana. In primo luogo, pesare 0,2 grammi di acido oleico liquido a temperatura ambiente. Aggiungere 1,5 millilitri di PBS sterile di grado coltura e riscaldare la miscela a 70 gradi Celsius per un'ora assicurandosi di vortice a intermittenza.
Successivamente, pesare 5,89 grammi di BSA privo di acidi grassi e scioglierlo in 33,9 millilitri di PBS. Riscaldare la miscela in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius fino a quando la BSA non è completamente sciolta. Vortice la miscela di acido oleico di nuovo per creare un'emulsione di goccioline fini e aggiungerlo immediatamente alla soluzione BSA utilizzando una pipetta di vetro.
Mantenere la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti fino a quando non rimane una soluzione giallastra chiara. Passare gli organoidi come descritto in precedenza e seminare le singole cellule derivate da organoidi in una piastra nera a fondo chiaro da 96 po '. Il sesto giorno di coltura su hSI-EM, sostituire il mezzo di coltura con hSI-EM contenente un millimolare dell'acido oleico e coniugato BSA.
Incubare le cellule per 16-17 ore a 37 gradi Celsius in presenza o assenza di inibitore del DGAT1 micromolare 0,1. Successivamente, aspirare il mezzo senza disturbare le goccioline della matrice della membrana basale. Fissare gli organoidi aggiungendo 100 microlitri di formaldeide tamponata neutra al quattro per cento ai pozzi per 30 minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere delicatamente e accuratamente la formaldeide con 150 microlitri di PBS per pozzo. Macchiare le cellule per goccioline lipidiche con 025 milligrammi per millilitro LD540 e DAPI in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Quindi lavare accuratamente i pozzi con PBS.
Per immagini panoramiche di interi organoidi utilizzare un soggettivo 40X adatto per l'imaging fluorescente confocale. Impostare il microscopio sull'immagine per DAPI e il colorante LD540 utilizzando le impostazioni di eccitazione ed emissione mostrate qui. Impostare le dimensioni del foro stenopeica su un'unità ariosa per una risoluzione sufficiente dell'asse Z.
Per l'immagine della metà di un organoide sferico impostare una pila z su circa 85 micrometri. Utilizzando un sistema di elaborazione delle immagini appropriato, trasformate lo z-stack di ogni organoide in una proiezione massima facendo clic su Immagine, Pile, Progetto Z. Impostare la soglia della proiezione massima su un livello in cui non è visibile alcun segnale LD540 nel campione di controllo del veicolo BSA facendo clic su Immagine, Regola, Soglia.
Usa queste impostazioni per sogliare ogni immagine. Quindi misurare l'area totale della fluorescenza per ogni proiezione massima utilizzando la funzione Analizza, Analizza particelle. Per una corretta analisi della formazione di goccioline lipidiche, gli organoidi non devono essere seminati troppo densamente prima della stimolazione con acido oleico e della successiva colorazione.
Ciò è particolarmente importante per la lettura confocale e lettore di lastre poiché gli organoidi sovrapposti potrebbero interferire con la fluorescenza. Dopo la stimolazione con un millimolare di acido oleico durante la notte, la formazione di goccioline lipidiche può essere visualizzato con un microscopio a campo luminoso invertito. L'accumulo di goccioline lipidiche disperde la luce trasmessa, e quindi gli organoidi appaiono più scuri, mentre gli organoidi non stimolati hanno un aspetto traslucido.
Una volta che gli organoidi stimolati dall'acido oleico sono fissi e macchiati, la formazione di goccioline lipidiche può essere visualizzato utilizzando un microscopio confocale. Poiché gli organoidi sono strutture 3D, un normale microscopio epifluorescente non è adatto a causa del segnale di fondo fuori fuoco, quindi una pila z confocale viene utilizzata per caratterizzare la LDF negli organoidi. La quantificazione dei campioni di microscopia confocale può anche essere eseguita utilizzando un lettore di lastre fluorescenti normalizzato al segnale fluorescente Hoechst.
Il saggio del lettore di lastre indica una significativa diminuzione del segnale LD540 nelle cellule organoidi trattate con inibitore DGAT1 rispetto agli organoidi non trattati. La quantificazione della formazione di LD nelle singole cellule può essere ottenuta utilizzando un citometro a flusso. La strategia di gating qui mostrata è per gli organoidi intestinali umani dissociati.
Istogrammi rappresentativi sia per l'SSC-A che per il segnale LD540 della popolazione finale di cellule vive mostrano che la formazione di goccioline lipidiche comporterà un aumento della SSC-A a causa della formazione di goccioline lipidiche intracellulari. Inoltre, le macchie di LD540 per i lipidi che vengono immagazzinate nelle goccioline lipidiche e il segnale aumenterà anche all'induzione della formazione di goccioline lipidiche. Come tale, la formazione di goccioline lipidiche è misurata come uno spostamento dell'intensità fluorescente media sia di SSC-A che di LD540.
Le fasi più cruciali di questo protocollo sono la coltura di organoidi intestinali umani e la corretta ondulatazione dell'acido oleico in BSA. Per soddisfare più condizioni, questo test può essere analizzato utilizzando un lettore di lastre fluorescenti. Per correggere il numero organoide per pozzo, il segnale LD540 è stato normalizzato al segnale DAPI.
Con questa tecnica, i ricercatori possono studiare la formazione di goccioline lipidiche nei sistemi organoidi e migliorare varie tecniche di analisi come la microscopia elettronica per convalidare i loro risultati.
