Il nostro protocollo può essere utilizzato per produrre vescicole extracellulari arricchite di esosomi di alta qualità da cellule staminali embrionali che esprimono il fattore immunostimolante, GM-CSF. Le vescicole extracellulari arricchite di esosomi che trasportano GM-CSF, hanno il potenziale per servire vescicole immuno-regolatorie prive di cellule che possono modulare la risposta immunitaria. I ricercatori con la formazione di base di biologia molecolare e cellulare, dovrebbero essere in grado di facilmente come potrebbe questo protocollo, ma chiunque ese esegue questo protocollo per la prima volta dovrebbe seguire le indicazioni da vicino.
Poiché il nostro protocollo è complicato, visualizzare i dettagli intricati di ogni passaggio aiuterà altri ricercatori a generare FBS libero da esosomi, ultracentrifificare il volume desiderato di FBS e raccogliere il surnatante libero di esosomi. Prima di placcare le tre cellule ESD, rivestire piatti di coltura tissutale di 15 centimetri con 0,1% di gelatina a temperatura ambiente per 30 minuti. Rimuovere la gelatina per aspirazione e colturare le tre cellule ESD senza cellule dello strato di alimentazione in ESD tre terreno di coltura cellulare a 37 gradi Celsius in 5% Incubatore umidificato di anidride carbonica fino a quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza.
Lavare le colture quasi confluenti con cinque millilitri di 0,05% di tripsina per piatto seguito da un'incubazione di cinque minuti a 37 gradi Celsius in tripsina fresca. Alla fine dell'incubazione tirare le cellule staccate in un tubo di centrifuga e inattivare la tripsina con cinque millilitri di terreno di coltura fresco. Sedimentare le cellule mediante centrifugazione e sospendere nuovamente i pallet in mezzo fresco per il conteggio Per il passaggio, piastra cinque volte 10 alla sesta dell'ESD tre cellule in 15 millilitri di terreno di coltura cellulare su nuove piastre rivestite di gelatina per tre giorni di coltura prima di sub-coltura delle cellule Per raccogliere il surnatante di coltura cellulare per l'isolamento della piastra di vescicole extracellulari arricchite di esosoma una volta da 10 alla settima ESD tre cellule in 15 millilitri di terreno di coltura cellulare per nuova piastra rivestita di gelatina per tre giorni prima di raccogliere i supernatanti di coltura cellulare Per l'isolamento delle vescicole extracellulari arricchite di esosomi, sedimentare prima i grandi frammenti cellulari all'interno dei supernatanti raccolti da tre cellule ESD coltivate in 72 ore mediante centrifugazione.
Dopo aver raccolto il surnatante, Ultracentrifuga i campioni e scartare i supernatanti. Risciacquare delicatamente ogni pallette due volte con un millilitro di PBS per lavaggio per rimuovere qualsiasi surnatante residuo di coltura e quantificare il contenuto proteico extracellulare arricchito di esosomi con un test dell'acido bicinchoninico, secondo le istruzioni del produttore. Quindi sospendere di sospendere le vescicole extracellulari arricchite con esosoma in PBS a una concentrazione di sei microgrammi per micrometro per la conservazione a meno 80 gradi Celsius.
Per visualizzare le vescicole extracellulari arricchite di esosomi mediante microscopia elettronica a trasmissione fissare da tre a cinque microgrammi per millilitro delle vescicole extracellulari con la concentrazione finale del 2% di paraformaldeide a griglia del microscopio elettronico a temperatura ambiente per due ore. Al termine dell'incubazione, caricare 10 microlitri dei campioni fissi su griglie di rame con pellicola di supporto al carbonio per un minuto prima di drenare le griglie con carta da filtro, rimanere nelle griglie con una soluzione di colorazione appropriata, secondo il protocollo del produttore e utilizzare una pinzetta per trasferire le griglie su un pezzo di carta da filtro, quindi utilizzare il microscopio elettronico a trasmissione con un ingrandimento di 50.000 volte per acquisire immagini al microscopio elettronico, secondo i protocolli standard. Per preparare estratti di cellule intere, raccogliere ESD tre cellule dalla coltura come dimostrato e sospendere nuovamente le cellule raccolte in PBS per il conteggio.
Dopo una seconda centrifugazione, sospendere nuovamente le celle da cinque volte 10 alla terza celle per microlitro di buffer di caricamento della pagina SDS contenente la concentrazione dello 0,5% di SDS e sonicare i campioni per 10 secondi su un sonicatore con un'ampiezza del 10%. Quindi riscaldare i campioni a 100 gradi Celsius per cinque minuti. Per preparare i lisati per le vescicole extracellulari arricchite con esosomi, sospendere nuovamente le vescicole extracellulari arricchite con esosomi nel buffer di caricamento della pagina SDS contenente lo 0,5% di SDS a una concentrazione di 1,2 microgrammi per microlitro e sonicare i campioni per 10 secondi come dimostrato, quindi riscaldare i campioni a 100 gradi Celsius per cinque minuti.
Per l'analisi Western Blot, caricare 10 microlitri estratto all'ingrosso e campioni di lisato di vescicole extracellulari arricchiti con esosomi in singoli pozzetto di un miglior gel di pagina di stress. Alla fine della corsa, trasferire le proteine sulle membrane PVDF e incubare le membrane con gli anticorpi primari e secondari appropriati di interesse, quindi rilevare l'espressione proteica utilizzando un kit di rilevamento della chemiluminescenza migliorato, secondo le istruzioni del produttore. Per valutare la quantità di GM-CSF all'interno di vescicole extracellulari arricchite con esosomi, utilizzare un kit Murine GM-CSF per rivestire una piastra ELISA con anticorpo di cattura anti GM-CSF successivamente, trattare 0,6 microgrammi di campioni di vescicole extracellulari arricchite di esosomi con 100 microlitri di PBS da solo, o PBS più 0,05% interpolazione 20 a temperatura ambiente per 30 minuti.
Al termine dell'incubazione, aggiungere i campioni trattati ai singoli pozzetti della piastra ELISA preparata per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente seguita dal lavaggio dei pozzetti corrispondenti appropriati con PBS da solo, o PBS più 0,05% tra 20. Dopo il lavaggio, aggiungere l'anticorpo di rilevamento ai campioni per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente seguita da un lavaggio con PBS da solo o PBS più 0,05% interpolazione 20 come dimostrato, quindi aggiungere Avidin Horseradish Peroxidase ai campioni per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente, seguita da un lavaggio e misurando l'assorbanza in ciascun pozzetti su un lettore di micropiastre a 450 nanometri. L'intensità di fluorescenza GFP di una linea cellulare GM-CSF che esprime ESD a tre linee cellulari o di una linea ESD a tre cellule che esprime un vettore vuoto è molto più alta di quella delle loro controparti parentali.
ELISA rivela che tre cellule ESD che esprimono GM-CSF producono livelli marcatamente più elevati di GMCSF nella loro coltura cellulare surnatante rispetto alle cellule di controllo vettoriale vuote. Inoltre, la quantità di GM-CSF generata da GM-CSF che esprime tre cellule ESD è simile a quella prodotta dai fibroblasti STO che esprimono GM-CSF. La microscopia elettronica a trasmissione di vescicole extracellulari isolate da colture cellulari trasdotte da vettori e trasdotte GM-CSF rivela vescicole di diverse dimensioni che rientrano nell'intervallo di diametro previsto da 30 a 100 nanometri.
L'espressione di marcatori esosomiali, tra cui CD81, Annexin V e flotillin-1 è marcatamente migliorata nelle vescicole extracellulari, isolate da tre cellule ESD rispetto ai corrispondenti estratti all'ingrosso mediante analisi Western blot. È importante sottolineare che la presenza di altri marcatori compartimentali subcellulari in ESD tre vescicole extracellulari derivate non è stata rilevata, tra cui il marcatore del reticolo endoplasmatico, la proteina disolfuro isomerasi, i marcatori mitocondriali, il citocromo C e il complesso Oxphos IV-subunità IV e il marcatore citosolico GAPDH. Dopo il lavaggio con 0,05% tween 20, i livelli di fondo GM-CSF rilevati nelle vescicole extracellulari di controllo sono stati significativamente ridotti.
Al contrario, i livelli di GM-CSF nelle vescicole extracellulari delle cellule che esprimono GM-CSF sono stati significativamente aumentati di 20 anni. L'acquisizione di vescicole extracellulari arricchite di esosomi di alta qualità che trasportano GMCSF è il passo più importante per il successo di questo protocollo. I ricercatori possono eseguire ulteriori esperimenti, come studi su linee cellulari dipendenti da GM-CSF e animali per determinare se le vescicole extracellulari arricchite di esosomi che si prendono cura del GM-CSF possono funzionare come vescicole immunoregolatrici prive di cellule.
Queste vescicole extracellulari arricchite di esosomi possono quindi essere utilizzate per esplorare come la modulazione della risposta immunitaria influisce su diverse condizioni di malattia.
