Complesso di tessuti multicellulari, questo protocollo ricostituisce la condotta cellulare in modo semplificato. Una cosa è questa tecnica per studiare le relazioni dirette tra protoni conduttori cellulari e risposta cellulare. Questo protocollo utilizza perline di polistirolo chimicamente funzionali per ricostituire i protoni conduttori cellulari.
Le perline possono essere tagliate con qualsiasi protone di interesse, per testare i loro effetti sulla risposta cellulare. Abbiamo usato questo metodo in C-Elegance sugli embrioni di topo. Pertanto, questo protocollo può essere retto agli studi di organismi larghi.
Poiché gli embrioni sono fragili dopo un alto trattamento completo di clorite, è necessaria una pratica significativa prima di poter isolare con successo il blastomero. La dimostrazione visiva fornirà una maggiore comprensione di come si dovrebbe gestire il capillare durante i metodi di isolamento del blastomero. Per iniziare, pesare 10 milli-grammi di perline di polistirolo modificato carbossilato in un tubo di micro centrifuga da 1,5 milli litri.
Aggiungere un milli-litro di tampone MES nel tubo per lavare. Vortice il tubo per mescolare le perline. Ruotare il tubo per 60 secondi a 2000XG tramite centrifuga da banco.
Dicardare il supernatante tubazionando con cura il buffer. Lavare di nuovo le perline con un milli-litro di buffer MES. Dopo il lavaggio, aggiungere un milli-litro di tampone MES contenente 10 milli-grammi di EDAC nel tubo, per attivare i gruppi carboxili di superficie.
Vortice il tubo per mescolare le perline. Ruotare e incubare il tubo per 15 minuti a temperatura ambiente. Fai girare le perline per 60 secondi a 2000XG.
Scartare il supernatante pippetting con cura il tampone e lavare con un milli-litro di PBS. Vortice il tubo per mescolare le perline e ripetere il lavaggio PBS ancora una volta. Preparare un milli-litro di una serie di diluizione di Rhodamine Red-X da 0,10, 100 e mille volte dalla soluzione di 0,65 milli-litro Rhodamine Red-X.
Pippette 20 micro litri di perline in ogni tubo di diluizione seriale. Ruotare e incubare i tubi per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare le perline due volte con un milli-litro di PBS.
Dopo il lavaggio, aggiungere un milli-litro di PBS nei tubi e conservarli a quattro gradi Celsius per un massimo di sei settimane. Controllare l'intensità di fluorescenza delle perline al microscopio utilizzato per l'imaging dal vivo. Tenere ogni estremità di un micro-capillare ad una capacità di 10 micro litri con mano destra e sinistra.
Tirare il micro-capillare verso entrambe le estremità per applicare la tensione e portare il centro del capillare sopra un bruciatore per realizzare due capillari tirati a mano. Al microscopio sezionato, tagliare le punte dei capillari tirati a mano con le forcep. Rendere le due dimensioni di apertura della punta circa due volte e una volta la breve lunghezza di accesso degli embrioni C-Elegance rispettivamente per il trasferimento dell'embrione e la rimozione del guscio d'uovo.
Attaccare il capillare tirato in un apparato di pippetting bocca. Pippette 45 micro-litri di sale d'uovo soluzione su un pozzo di uno scivolo multi-welled. Posiziona da cinque a 10 C-Elegance adulti sul pozzo.
Per ottenere i primi embrioni C-Elegance tagliare gli adulti a pezzi posizionando due aghi a destra e a sinistra del corpo di C-Elegance e facendo scorrere gli aghi l'uno accanto all'altro. Pippette 45 micro litri di soluzione di ipoclorito su un pozzo vicino alla soluzione di sale d'uovo ben contenente e pippette 45 micro-litri di Shelton's Growth Medium sui successivi tre pozzi. Trasferire uno stadio cellulare e i primi due embrioni dello stadio cellulare nella soluzione di ipoclorito dalla pippette della bocca con l'apertura di dimensioni maggiori e attendere da 40 a 55 secondi.
Lavare gli embrioni trasferendoli nei successivi tre pozzi con il mezzo di crescita di Shelton. Con uno o due secondi in ciascuno dei primi due pozzi. Utilizzando il capillare disegnato a mano con l'apertura di dimensioni più piccole ripetere accuratamente pippetting l'embrione per la rimozione del guscio d'uovo.
Successivamente, pippette continuamente con il capillare disegnato a mano per separare i blastomeri embrionali a due cellule. Dopo la rimozione del guscio d'uovo, ridurre al minimo la forza nel pippetting degli embrioni su e giù per prevenire lo scoppio. Preparare una camera di imaging posizionando un coverslip su un portascipelli e rastrepare i bordi della coverslip per ripobalizzarla.
Capovolgere il portascipelli e disegnare un cerchio sul coverslip con una penna idrofobica. Aggiungere il mezzo di crescita di Shelton all'interno del cerchio disegnato dal marcatore idrofobico e trasferire il blastomero isolato nella camera di imaging all'interno del cerchio. Ora, erogare un piccolo volume delle perline funzionalizzate chimicamente sul coperchio usando il capillare disegnato a mano con l'apertura più grande.
Controllare la posizione delle perline soffiando nel capillare disegnato a mano fino a quando le perline non si attaccano al blastomero isolato. Montare il coverslip per evitare l'evaporazione del mezzo ed eseguire immagini dal vivo utilizzando un microscopio invertito. In questo studio, il segnale fluorescente dalla perla trattata con 0,005 micro-grammi per milli-litro Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester per il ceppo transgenico che esprime GFP miosin-2 e M-cherihistone era troppo debole.
D'altra parte, il segnale fluorescente delle perline trattate con cinque micro-grammi per milli-litro Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester era troppo forte. La concentrazione di Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester a 0,5 micro-grammi per milli-litro è stata ottimale per questo particolare ceppo transgenico. Durante l'imaging dal vivo è stato identificato un piano in cui due centrosomi erano allineati verticalmente.
Il piano con più o meno 90 gradi di angolo di questo piano è il piano del mandrino. L'angolo di orientamento del mandrino rispetto all'interfaccia di contatto cella/perline dopo la citocinesi mostra che entrambe le cellule figlie erano attaccate al tallone in una linea che passa entrambe le attrazioni di contatto è stata utilizzata come orientamento di contatto. Bisogna imparare come gli embrioni e il guscio d'uovo reagiscono a certe forze esterne applicate dalla pippette della bocca.
Teoricamente, qualsiasi risposta cellulare può essere studiata, ad esempio, le specifiche del solfato possono essere studiate coltivando le cellule e il contatto con perline adesive su termini più lunghi. Questa tecnica è stata utilizzata per comprendere il meccanismo di orientamento della divisione cellulare dipendente dal contatto. Il filtro PTF è stato utilizzato per prevenire l'inalazione di fumi di soluzione di ipoclorito tramite pippette per bocca.
