Questo protocollo consente ai ricercatori di coltura delle colonie di cellule staminali sugli idrogel con il controllo completo sia sulla rigidità dell'idrogel che sulla geometria delle colonie. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente ai ricercatori di coltura delle colonie di cellule staminali in condizioni che imitano meglio l'ambiente fisiologico rispetto alla plastica per la coltura tissutale. Quando si esegue questo protocollo per la prima volta, assicurarsi di generare alcuni extra di ogni materiale e utilizzare un ligando fluorescente in modo da poter risolvere i problemi e ottimizzare in ogni passaggio.
Questa tecnica prevede più passaggi che comportano il posizionamento preciso di vari materiali. È molto più facile capire le istruzioni scritte per questo protocollo una volta che l'hai visto eseguito. Per iniziare questa procedura, mescolare la base PDMS con l'agente di polimerizzazione PDMS con un rapporto 10 a uno in peso e mescolare accuratamente.
Degasare questa miscela in un essiccatore per 30-60 minuti o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse. Versare lentamente e uniformemente la miscela PDMS sulla superficie del wafer preparato. Toccare il piatto sulla superficie di lavoro per rilasciare eventuali bolle d'aria dalla superficie del wafer.
Cuocere il PDMS a 70 gradi Celsius per due ore e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Quindi tagliare il PDMS in circa 10 per 10 millimetri quadrati, ognuno contenente le caratteristiche per una singola condizione sperimentale. Questi saranno indicati come francobolli per il resto del protocollo.
Successivamente, mescolare la base PDMS con l'agente polimerizzante PDMS con un rapporto di otto a uno in peso e mescolare accuratamente. Degasare la miscela in un essiccatore per 30-60 minuti o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse. Quindi, versare lentamente e uniformemente il PDMS in un piatto pulito da 100 millimetri.
Toccare il piatto sulla superficie di lavoro per rilasciare eventuali bolle d'aria. Cuocere il PDMS a 70 gradi Celsius per due ore e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. Per ogni timbro generato in precedenza, tagliare un quadrato di 15 per 15 millimetri di PDMS.
Queste saranno denominate lastre piatte per il resto del protocollo. Invertire ogni timbro generato su una lastra piatta di PDMS in modo che le caratteristiche sul supporto a contatto con una lastra piatta di PDMS. Premere delicatamente sulla parte superiore del timbro con le forceps per garantire un contatto uniforme.
Quindi, posizionare una piccola goccia di polimero polimero polimerizzato UV nell'interfaccia superiore di ogni coppia di francobolli e lastre. Il polimero sarà malvagio tra i due per tensione superficiale assistita dalla gravità. Posizionare una piccola goccia del polimero curvibile UV attorno ai bordi dell'interfaccia timbro e lastra.
In questo modo viene creato un bordo che conterrà la soluzione del ligando. Quindi posizionare con cura il timbro e schiaffeggiare le coppie in una scatola di sterilizzazione UV. Utilizzare l'impostazione sterile dell'alimentazione STR ed esporre per 10 minuti.
Successivamente, rimuovere le coppie dalla scatola di sterilizzazione UV e utilizzare due coppie di forcelle per rimuovere delicatamente il timbro tenendo premuta la lastra piatta e lo stencil che si formano dal polimero polimero polimerabile UV. Utilizzando le forcelle, rimuovere con cura lo stencil e invertirlo in modo che la superficie a contatto con la lastra piatta di PDMS sia rivolta verso l'alto. Riposizionare gli stencil invertiti nella scatola di sterilizzazione UV.
Utilizzare l'impostazione sterile dell'alimentazione STR ed esporre per tre minuti. Utilizzando le forcep, posizionare con cura ogni lato piatto dello stencil verso il basso su un coverslip lavato con acido assicurandosi che le feature siano centrate sullo scivolo di copertura. Posizionare un piccolo pezzo di pellicola da laboratorio sopra ogni stencil.
Premere saldamente e uniformemente lo stencil per creare un forte contatto tra lo stencil e il copripalla. Posizionare i foglietti di copertura con stencil in un piatto. Mettere questo piatto in un detergente al plasma e applicare plasma ad alta potenza per 30 secondi.
Quindi, pipettare la soluzione di ligando sulla superficie di ogni stencil. Per gli stencil realizzati con timbri quadrati da 10 per 10 millimetri, applicare 100 microlitri per stencil. Successivamente, avvolgere il piatto contenente le fogliette di copertura in pellicola di laboratorio e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.
In primo luogo, lavare il coverslip con stencil utilizzando le forcep per immergerlo brevemente in un piatto contenente PBS sterile. Immergere il coverslip con stencil in un secondo stadio di PBS per lavarlo di nuovo. Rimuovere lo stencil dalla superficie del coverslip facendo attenzione a non rompere il coverslip.
Successivamente, immergere brevemente il coverslip in un piatto contenente acqua ultrapura per rimuovere i sali dai lavaggi PBS. Toccare il bordo del copripacchi per una delicata salvietta per eliminare l'acqua in eccesso. Asciugare il coperchio scivolare sotto un gas inerte come l'azoto.
Quindi, preparare una soluzione di poliacrilammide per ottenere l'elasticità idrogel desiderata. Per ogni coverslip modellato, preparare un labbro inferiore attivato in glutaraldeide con un distanziale posizionato sopra. Pipetta tra 75 e 150 microlitri di soluzione di poliacrilammide al centro di ogni coverlip attivata di glutaraldeide.
Utilizzando le forcep, posizionare un motivo per coprire lo scivolamento su ogni copertura attivata della glutaraldeide scivolare con poliacrilammide e distanziale in modo che il ligando modellato affronti la soluzione di poliacrilammide. Posizionare con cura ogni sandwich di poliacrilammide in un porta cappuccio con fili compatibili con tubi inferiori conici da 15 millilitri. Avvitare un tubo inferiore conico da 15 millilitri in ogni supporto del cappuccio per tenere in posizione i panini in poliacrilammide.
Centrifugare a panini in poliacrilammide nei tubi in secchi oscillanti a 200 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere i tubi dalla centrifuga e metterli in rack per tubi per mantenere l'orientamento per altri 50 minuti per garantire la piena polimerizzazione. Quindi, rimuovere i panini dai tubi e immergerli in PBS.
Avvolgere il piatto in pellicola di laboratorio e incubare a temperatura ambiente per tre ore o a quattro gradi Celsius durante la notte. Successivamente, utilizzare un bisturi e le forceps per rimuovere con cura il motivo per coprire gli scivolamenti e il distanziale dal sandwich di poliacrilammide mentre rimane immerso in PBS. Posizionare ogni coverlip con poliacrilammide fantasia in un porta cappuccio.
Luogo della guarnizione sopra lo scivolo di copertura e intorno alla poliacrilammide dove si trovava il distanziale. Avvitare un tubo inferiore conico da 15 millimetri segato nel supporto del cappuccio, formando un pozzo con la poliacrilammide modellata nella parte inferiore. Questi gruppi si inseriscono nei pozzi di una piastra standard da 12 pozzali per una facile maneggevolezza.
Quando si esegue questa tecnica, utilizzare un ligando fluorescente per assicurarsi che il modello desiderato venga creato sulla superficie dello scivolo di copertura del vetro e trasferito con successo sulla superficie dell'idrogel di poliacrilammide durante la polimerizzazione. La misura definitiva del successo di questo metodo è la capacità di coltura degli hESC nelle geometrie desiderate sugli idrogel modellati. Se coltivati come delineato nel protocollo di testo, gli hESC in genere proliferano per completare le geometrie con motivi da 48 a 72 ore una volta che l'Y27632 è stato completamente rimosso dal supporto.
La coltivazione di colonie hESC in geometrie confinate su idrogel di poliacrilammide consente la misurazione delle forze di trazione generate dalle cellule utilizzando la microscopia a forza di trazione. Queste misurazioni vengono effettuate incorporando microsfere di fluorescenza nell'idrogel e imaging delle posizioni di queste perline prima e dopo la semina degli HESC. Le immagini delle posizioni dei perline possono essere utilizzate per generare mappe di spostamenti di perline che possono essere successivamente utilizzate per calcolare le sollecitazioni di trazione sottostanti.
Nelle colonie circolari di hESC, le maggiori sollecitazioni di trazione si trovano vicino al bordo periferico delle colonie, mentre il centro delle colonie mostra sollecitazioni di trazione uniformemente basse. Nonostante le distribuzioni non uniformi osservate delle sollecitazioni di trazione, gli hESC coltivati come cerchi modellati in condizioni di manutenzione, mostrano un'espressione uniforme del marcatore di pluripotenza Oct 3/4 e della molecola di adesione cellulare E-cadherin. Questa tecnica consentirà ai ricercatori di modellare meglio gli embrioni umani utilizzando cellule staminali embrionali umane, portando infine a importanti intuizioni su come si sviluppano gli esseri umani.
Questa procedura può essere adattata per qualsiasi applicazione in cui un ricercatore mira a coltura di cellule in geometrie definite su idrogel morbidi. Questa procedura è compatibile con la maggior parte degli acidi biochimici, consentendo ai ricercatori di rispondere a domande su come cose come la geometria dei tessuti e le forze generate dalle cellule influenzano l'espressione proteica e la segnalazione cellulare. Molti ricercatori stanno ora utilizzando cellule staminali embrionali umane per modellare lo sviluppo umano precoce.
Questa tecnica consentirà ai ricercatori di rispondere a queste importanti domande in condizioni che imitano meglio un ambiente fisiologico.
