Questo protocollo è utile per determinare le modifiche nell'attivazione NF-kappa-B nelle celle che esprimono un reporter luciferasi NF-kappa-B. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente uno schermo ad alta produttività di fattori o condizioni che portano a cambiamenti nell'attivazione NF-kappa-B. L'NF-kappa-B è un fattore di trascrizione per un'ampia varietà di processi cellulari.
Una funzione ben nota di NF-kappa-B è nell'induzione di risposte infiammatorie inducendo l'espressione di varie citochine e chemiochine. Il nostro laboratorio è particolarmente interessato all'induzione di NF-kappa-B indotta dall'agente patogeno Salmonella typhimurium. Qui, usiamo la linea cellulare HeLa che è stabilmente trasfettata con un plasmide reporter NF-kappa-B luciferasi.
Altri batteri, o anche virus o composti chimici, possono essere utilizzati in questa linea cellulare per studiare l'attivazione di NF-kappa-B. Altre linee cellulari possono anche essere utilizzate se è possibile introdurre un tale plasmide reporter NF-kappa-B luciferasi in quella linea cellulare. Qualcuno che lo fa per la prima volta può avere problemi a utilizzare correttamente la tecnica sterile necessaria per la coltura cellulare e il lavoro batterico.
Un giorno prima della stimolazione cellulare, rimuovere il supporto di crescita delle cellule HeLa 57A che sono state coltivate fino a circa il 75% di confluenza. Lavare le celle con un millilitro dello 0,05% di trippsina EDTA. Sostituire con un altro millilitro di tripside EDTA e trasferire il pallone in un incubatore di 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Dopo che le cellule sono state staccate dal pallone, sospenderle in 10 millilitri di mezzi di crescita. Combina 10 microlitri di sospensione cellulare con 10 microlitri di blu Trypan, pipetta su e giù per mescolare e trasferisci 10 microlitri in uno scivolo del contatore cellulare. Contare le cellule in sospensione usando un contatore di cellule e utilizzare i mezzi di crescita per diluire le cellule a una concentrazione finale di 2,5 per 10 alle cinque cellule per millilitro in un tubo conico da 50 millilitri.
Trasferire 250 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra da 48 porri. Fissare periodicamente e capovolgare il tubo conico per garantire una sospensione cellulare omogenea. Toccare delicatamente la piastra sul lato per assicurarsi che le cellule distribuiscano uniformemente nei pozzi.
Trasferire la piastra a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5% e consentire alle cellule di attaccarsi e crescere durante la notte. Scorte congelate di Salmonella su piastre di agar LB per produrre singole colonie. Trasferire le piastre in un'incubatrice impostata a 37 gradi Celsius e consentire la crescita notturna.
Il giorno dopo, aggiungere tre millilitri di LB a tubi di coltura batterica sterili e aggiungere antibiotici appropriati al supporto. Utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, scegliere una singola colonia dalle colture batteriche striate e toccare il ciclo al supporto LB. Limitare i tubi dopo l'inoculazione e scartare il ciclo.
Posizionare i tubi in un'incubatrice di scuotimento impostata a 37 gradi Celsius e 180 RPM, quindi consentire ai batteri di crescere durante la notte. Al mattino, recupera colture batteriche durante la notte dall'incubatrice. Preparare i tubi per la sottocoltura aggiungendo tre millilitri di LB fresco e antibiotici.
Trasferire 30 microlitri della coltura batterica durante la notte sui mezzi appena preparati. Posizionare i tubi in un incubatore di scuotimento impostato a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo l'incubazione di tre ore, trasferire un millilitro di brodo LB sterile in una cuvetta di plastica per fungere da vuoto.
Trasferire 900 microlitri di LB nelle altre cuvette da utilizzare per l'analisi del campione. Trasferire 100 microlitri di sottocoltura batterica in una cuvetta contenente 900 microlitri di LB e pipettare su e giù più volte per mescolare. Ripeti questo per ogni sospensione batterica.
Accendere lo spettrofotometro per misurare la densità ottica delle colture batteriche ad una lunghezza d'onda di 600 nanometri. Posizionare lo spazio vuoto nello spettrofotometro. Prendi nota dell'orientamento.
Chiudere il coperchio e premere il pulsante vuoto sullo spettrofotometro per ottenere l'assorbanza dello sfondo. Sostituire la cuvetta vuota con una cuvetta campione nello stesso orientamento e premere lettura. Registrare i valori OD600 di questi campioni.
Moltiplicare il valore per 10 per tenere conto del fattore di diluizione. Diluire la sospensione da uno a 10 in una cuvetta e misurare l'assorbanza, che dovrebbe dare un valore di circa 0,1 che corrisponde approssimativamente a uno per 10 al nove CFU per millilitro. In un nuovo tubo, aggiungere un volume appropriato della sottocoltura diluita alla LB fresca per ottenere una sospensione di uno per 10 all'otto CFU per millilitro da utilizzare come inoculo.
Preparare le diluizioni seriali dell'inoculo trasferendo 50 microlitri di sospensione batterica in un tubo contenente 450 microlitri di PBS sterile fino a quando non viene effettuata una diluizione finale di circa 100 CFU per millilitro. Trasferire 100 microlitri delle due diluizioni più basse, 100 e 1000 CFU per millilitro, in due piastre di agar LB e stendere la sospensione con uno spargitore di cellule per ottenere singole colonie. Trasferire queste piastre in un incubatore Celsius di 37 gradi e incubare durante la notte.
Il giorno seguente, contare le colonie e calcolare la concentrazione batterica dell'inoculo iniziale per determinare l'effettiva concentrazione di inoculo. Lo stesso giorno, etichettare il coperchio della piastra in base alle condizioni di infezione che verranno utilizzate per ogni pozzo, con ogni condizione eseguita in triplice copia. Aggiungere 10 microlitri dell'inoculo ai pozzi appropriati e aggiungere 10 microlitri di LB sterile a pozzi di controllo non infetti.
Per sincronizzare il tempo di infezione, posizionare la piastra in una centrifuga da tavolo e girare a 500 volte G per cinque minuti, assicurando che la piastra sia controbilanciata. Quindi, trasferire le cellule infette in un incubatore di anidride carbonica del 5% a 37 gradi Celsius per un'ora. Posizionare un tubo conico da 15 millilitri contenente un'aliquota di mezzi di coltura cellulare in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius da utilizzare nel passaggio successivo.
Un'ora dopo il momento dell'infezione, rimuovere il tubo conico da 15 millilitri contenente mezzi di coltura cellulare dal bagno d'acqua e pulire l'esterno con il 70% di etanolo. Trasferire le piastre di coltura tissutale dall'incubatrice a un armadio per la biosicurezza. Utilizzare punte sterili per aspirare i supporti dai pozzi e sostituirli con 250 microlitri di mezzi di coltura cellulare freschi e caldi.
Riportare le piastre all'incubatore di anidride carbonica del 5% a 37 gradi Celsius per altre quattro ore. Successivamente, rimuovere le piastre dall'incubatore di anidride carbonica e aspirare il supporto dai pozzi. Per l'analisi della luciferasi, aggiungere 100 microlitri di tampone di lysis cellulare 1X ai pozzi.
Trasferire la piastra in un congelatore negativo di 80 gradi Celsius e incubare per almeno 30 minuti per garantire un'efficiente lisi cellulare. Quindi, posizionare la piastra contenente lisato di cellule congelate su una panchina per scongelare e preparare i reagenti del substrato di luciferasi secondo le raccomandazioni del produttore. Lasciare che i reagenti del substrato di luciferasi equilibrano a temperatura ambiente.
Quindi, accendere il lettore di lastre e aprire il programma di lettura corrispondente. Impostare la macchina per misurare la luminescenza. Trasferire 10 microlitri di ogni cella lysate in un pozzo di una piastra opaca da 96 po'.
Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 microlitri del reagente del saggio luciferasi ad ogni pozzo della piastra opaca. Toccare delicatamente la piastra sul lato per mescolare i pozzi e assicurarsi che la superficie inferiore sia coperta di liquido. Posizionare il piatto in un lettore di lastre e iniziare la lettura.
Copiare i valori di luminescenza in un programma foglio di calcolo e tracciare i risultati. Questo protocollo si concentra sull'attivazione del fattore di trascrizione NF-kappa-B utilizzando un reporter luciferasi dipendente da NF-kappa-B che viene trasfetto stabilmente in una linea di cellule HeLa. Questa figura mostra un esperimento rappresentativo dell'attivazione della luciferasi dipendente dalla NF-kappa-B e dell'espressione genica IL6 nelle cellule HeLA 57A infettate dai ceppi di Salmonella typhimurium.
L'infezione da ceppo SL1344 di tipo selvaggio ha indotto un forte segnale luciferasi sia nell'espressione RLU che IL6, che è stato diminuito nelle cellule infettate dal mutante triplo sopB sopE2 sipA e ridotto a livelli di controllo con il mutante quadruplo sopB sopE2 sopE2 sipA. Prestare molta attenzione quando si evince le diluizioni seriali e la placcatura. Ciò ti assicurerà un inoculo coerente attraverso i tuoi ceppi.
Dopo aver identificato i fattori che contribuiscono all'attivazione NF-kappa-B e ai cambiamenti a valle nell'espressione dell'mRNA, la tecnica western blot può essere utilizzata per identificare i cambiamenti nell'espressione proteica. Questo protocollo ha permesso al nostro laboratorio non solo di valutare l'attivazione NF-kappa-B indotta dalla Salmonella, ma anche altri composti e proteine implicati nell'attivazione NF-kappa-B. Salmonella typhimurium è un agente patogeno umano.
Utilizzare DPI adeguati quando si lavora con questi batteri.
