Il metodo classico in cui le proteine di membrana vengono estratte per il loro studio è mediante semplice solubilizzazione in detergente. Mentre questo fornisce un metodo semplice e universale, i detergenti hanno dimostrato di alterare la struttura, la funzione e l'attività nativa di queste proteine sensibili. Qui presentiamo il Peptidisc come una soluzione per stabilizzare le proteine della membrana in soluzione priva di detergenti.
Il sistema Peptidisc si adatta spontaneamente alle dimensioni, alla forma e alla tipologia delle proteine della miriade di membrane. Questo è in contrasto con altri mimetici a membrana che spesso richiedono un'ottimizzazione noiosa. FhuA, una proteina della membrana esterna E.coli, sarà utilizzata come proteina bersaglio modello da ricostituire in questo protocollo.
Le vescicole della membrana esterna saranno isolate seguite dall'aggiunta di detersivo per solubilizzare le proteine della membrana. Il peptide Peptidisc viene aggiunto alla solubilizzazione e il detergente viene diluito via, formando spontaneamente particelle peptidisce. Queste particelle solubili stabilizzate sono ora disponibili per numerose applicazioni a valle.
Questo protocollo esaminerà l'interferometria a strato bio come applicazione della tecnologia Peptidisc. Questo protocollo si concentrerà sul metodo di ricostituzione peptiquick, una tecnica utile che facilita la purificazione simultanea e la ricostituzione delle proteine di membrana. Il metodo PeptiQuick di ricostituzione delle perline viene eseguito in una colonna di gravità Nickel-NTA IMAC standard pre-equilibrata nel detergente.
La membrana solubilizzata viene caricata sulla resina e le proteine non bersaglio vengono lavate via. Dopo che questo peptide viene aggiunto alla colonna e il detergente viene diluito rapidamente. Il lato idrofobico del peptide peptidisco si associa alle regioni idrofobiche esposte.
Il lato idrofilo del peptide mantiene la proteina solubile in soluzione. Il peptide in eccesso viene lavato via. L'imidazolo viene aggiunto per elute la furia ricostituita.
L'impalcatura Peptidisc può essere funzionalizzata per etichettare indirettamente le proteine della memoria e quindi aprire le porte a un insieme più ampio di analisi a valle. Qui sfruttiamo il peptide biotinilato per l'attacco a sensori rivestiti di streptavidina per l'analisi BLI. L'interferometria a strato bio-strato è una potente tecnica senza etichette per indagare le interazioni biomolecolari in soluzione.
Oltre a dimostrare semplicemente le interazioni, questa tecnica fornisce una lettura cinetica in tempo reale e consente il calcolo di una costante di dissociazione vincolante. Attraverso questo protocollo, eliminiamo la necessità di detersivo durante l'analisi BLI, in quanto ciò può alterare l'attività. L'interferometria del biostrato analizza il passaggio di interferenza della luce bianca riflessa dal sensore, o punta, e delle macro molecole legate durante un'interazione.
Per misurare le interazioni, la punta di senso viene passata tra le soluzioni e il segnale registrato ad ogni passaggio. Ogni suggerimento dà quindi la propria traccia su un sensogramma. Innanzitutto, viene stabilita solo una linea di base del buffer.
In secondo luogo, il ligando è legato. In questo caso, FhuA e peptidisc biotinylated legano una punta encoata di streptavidina. Successivamente, la punta viene lavata nel buffer per rimuovere qualsiasi FhuA non associato.
Ora la punta viene spostata in una soluzione con una concentrazione nota di alita, qui ColM. Se si verifica un'interazione, questo darà una curva di legame. Infine, la punta viene spostata nel buffer e la dissociazione misurata.
I tassi osservati per l'associazione e la dissociazione ad ogni concentrazione di colonna possono essere utilizzati per calcolare la costante di dissociazione. L'esaistidina taggata FhuA è espressa nel ceppo E-coli AW740 per 18 ore nei mezzi amminici. I batteri vengono raccolti per centrifugazione a 5.000 G a 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Il pellet di cellule risultante viene ri-sospeso nel tampone TSG e quindi dounced per rompere i grumi cellulari e garantire una lisi approfondita. Il TMSF viene aggiunto alle cellule ri-sospese ad una concentrazione finale di un millimolare poco prima della llisi. La llisi cellulare si ottiene con tre passaggi attraverso un microfluidizzatore a 15.000 PSI o una stampa francese a 8.000 PSI.
Le cellule liti vengono raccolte e viene eseguita una centrifugazione a bassa velocità a 5.000 G per 10 minuti a quattro gradi. Un supernatante dallo spin a bassa velocità viene caricato in un rotore a ultracentrifugo TI70 e centrifugato a 200.000 G per 40 minuti a quattro gradi per pellettizzare la membrana grezza E.coli. A seguito dell'ultracentrifugazione, il supernatante viene scartato e il pellet di membrana grezzo viene ri-sospeso in una quantità minima di tampone TSG.
Una membrana grezza viene sventata per garantirne l'omogeneità. Viene eseguito un saggio di Bradford per controllare la concentrazione proteica della membrana grezza ri-sospesa. Il tampone TSG viene utilizzato per diluire la membrana grezza a circa tre milligrammi per millilitro prima della solubilizzazione.
Tritone X-100 viene aggiunto alla membrana grezza ri-sospesa ad una concentrazione finale dell'1% per solubilizzare selettivamente la membrana interna batterica. La solubilizzazione viene eseguita per un'ora a quattro gradi, con un dolce dondolo. La membrana esterna non solubilizzata è isolata per ultracentrifugazione a 200.000 G per 40 minuti, a quattro gradi.
Il supernatante risultante contenente la membrana interna solubilizzata viene scartato. Mentre il pellet, contenente la membrana esterna, viene ri-sospeso come prima in TSG. L'LDAO viene aggiunto ad una concentrazione finale dell'1% alla membrana esterna sospesa e solubilizzato per un'ora a quattro gradi.
Infine, viene eseguita un'ultracentrifugazione, come in precedenza, al materiale insolubile a pellet. Il supernatante risultante contiene membrana esterna solubilizzata, incluso il nostro bersaglio, il suo FhuA taggato, ora pronto per la purificazione IMAC simultanea e la ricostituzione Peptidisc. Una colonna gravitazionale Nickel-NTA IMAC è pre-equilibrata con due volumi di colonna di tampone di lavaggio IMAC.
L'imidazolo viene aggiunto ad una concentrazione finale di cinque millimolare alla membrana esterna solubilizzata, diluita allo 0,04%LDAO. La membrana esterna solubilizzata viene caricata sulla resina Nickel-NTA e il flusso viene raccolto. Questo flusso viene ricaricato sulla resina per aumentare il legame resina di FhuA.
Dopo il caricamento, la resina viene lavata con 250 millilitri di tampone di lavaggio IMAC e i primi 50 millilitri raccolti. Dopo il lavaggio, il tampone di lavaggio viene drenato appena sopra l'altezza del letto di resina e il serbatoio della colonna chiuso. Un millilitro di concentrato, 10 milligrammi per millilitro, peptide Peptidisc viene aggiunto alla colonna.
Dopo l'aggiunta di peptide concentrato, vengono aggiunti 50 millilitri di diluito, un milligrammo per millilitro, peptide Peptidisc in TSG. La resina viene mescolata per sospendere di nuovo le perline in TSG, sotto il CMC di LDAO, formando così particelle peptidisce. Dopo l'intrappolamento peptidisc, la resina è autorizzata a depositarsi e la soluzione peptidica da un millilitro viene drenato attraverso la resina.
La resina viene lavata con 50 millilitri TSG per rimuovere il peptide Peptidisc in eccesso. Infine, le particelle peptidisce vengono diluite con 50 millilitri di imidazolo millimolare in TSG. Vengono raccolte frazioni millilitri e vengono aggiunti 10 microlitri di EDTA molare 0,5, uno ioni di nichel lisciviato leggero chiave.
Le frazioni di inizio, flusso, lavaggio ed eluso vengono caricate su un gel SDS del 12% ed elettrofosse per 30 minuti a 60 milliarti. Il gel è colorato e visualizzato su uno scanner di gel. Il gel risultante mostra l'esaurimento di FhuA nel flusso attraverso e l'arricchimento nell'eluizione.
Piccole bande contaminanti si osservano anche nelle frazioni eluse. Le frazioni da tre a sette sono selezionate per la cromatografia ad esclusione di dimensioni per confermare la solubilità di FhuA Peptidisc e esaurire i contaminanti. Un concentratore centrifugo tagliato da 30 Kilodome viene utilizzato per concentrare le frazioni da tre a sette.
Un millilitro delle frazioni di elusione IMAC raggruppate viene iniettato sulla colonna S200 con una portata di 0,25 millilitri al minuto nel buffer TSG. Vengono raccolte frazioni di millilitro e viene eseguito un gel SDS del 12% delle frazioni. Le frazioni pertinenti sono raggruppate e possono ora essere utilizzate nelle applicazioni downstream.
BLI è stato condotto in un ForteBio Octet RED96. Questo strumento sposta i perni BLI su una piastra da 96 pozzetti che viene impostata per la prima volta a mano. Tutti i pozzi sono riempiti con un volume finale di 200 microlitri.
La prima colonna è caricata con buffer cinetico per consentire alle punte di equilibrare e formare un segnale di base. La colonna due viene caricata con una concentrazione predeterminate del ligando e del buffer cinetico. In questo caso, FhuA è il ligando e viene aggiunto alla concentrazione di 2,5 microgrammi per millilitro.
Il suggerimento nella riga E verrà utilizzato come riferimento ed è caricato solo con buffer. La colonna tre è caricata con tampone cinetico per lavare l'FhuA in eccesso dalla punta. Due volte le diluizioni seriali dell'alita, in questo caso ColM, vengono caricate dall'alto verso il basso nella colonna quattro.
La più alta di queste concentrazioni viene utilizzata per la riga di riferimento, per misurare il legame non specifico dell'alita alla punta. La colonna cinque viene caricata con buffer. Qui, il ColM si dissocia, e la dissociazione misurata.
Una volta preparata la piastra, il vassoio della punta del sensore e la piastra preparata vengono caricati nello strumento BLI. Viene aperto il software di acquisizione dati BLI e viene avviato un nuovo esperimento cinetico. La scheda Definizione piastra viene utilizzata per inserire il layout della piastra da 96 pozzi nel software.
Qui il ligando FhuA viene inserito come carico mentre l'alyte ColM viene inserito come campione. La scheda Definizione saggio viene utilizzata per definire il periodo di tempo e la velocità di rotazione della piastra per ogni fase dell'esperimento. Qui includiamo un passaggio di base di 60 secondi, seguito da un passaggio di caricamento di 250 secondi, un secondo passaggio di base di 300 secondi, un passaggio di associazione di aliti di 450 secondi e infine un passaggio di dissociazione di 900 secondi.
Questi passaggi vengono assegnati singolarmente a ciascuna colonna della piastra da 96 po', selezionando il passo desiderato e facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'Add Assay su ogni colonna. La scheda di assegnazione del sensore viene utilizzata per garantire che lo strumento Octet prelevi i perni BLI dalla posizione corretta nel vassoio del sensore. La scheda Rivedi esperimento fornisce una panoramica finale dell'esperimento, prima dell'esecuzione.
BLI sarà ora effettuata dall'Octet RED. Questo produrrà un sensogramma di dati grezzi per l'analisi. L'analisi viene eseguita aprendo prima il software di analisi dei dati anagrafici Octet.
La scheda Selezione dati viene utilizzata per individuare l'esperimento e controllare il riepilogo sperimentale. Le concentrazioni dell'alita ColM sono immesse qui. Successivamente, la scheda Elaborazione viene utilizzata per sottrarre il segnale di riferimento dai dati sperimentali.
La linea di base è definita per allineare l'asse Y come se fosse stata applicata la velocità di des lega. Infine, viene selezionata l'opzione Elabora dati. I dati vengono isolati per questo esperimento ed è selezionata l'opzione Adatta curve.
Viene scelto un raccordo parziale di associazione e curva di dissociazione. Il Kd viene calcolato da questo raccordo. Il cromatogramma di esclusione delle dimensioni viene utilizzato per convalidare la ricostituzione dell'ambulante.
Il cromatogramma mostra un singolo picco simmetrico, suggerendo una preparazione proteica monodispersa. Il picco eluisce diversi millilitri dopo il volume del vuoto, indicando particelle peptidisce solubili non aggregate. Gli aggregati proteici eluiranno al volume vuoto, mentre i detergenti in eccesso e il peptide eluiranno dopo il picco principale.
L'aumento del lavaggio dei Peptidisc formati mentre è ancora attaccato alle perline Nickel-NTA dovrebbe esaurire quest'ultimo picco. Gli aggregati proteici sono spesso il risultato dell'esposizione delle proteine di memoria alla soluzione priva di detergenti prima della ricostituzione. Quest'ultimo cromatogramma di esclusione è una diagnostica utile per la risoluzione dei problemi relativi alla ricostituzione.
Dopo l'elaborazione dei dati sperimentali, una curva è adatta al sensogramma. L'accuratezza di questo raccordo è essenziale per il calcolo della costante di dissociazione. Il plottaggio della vista residua descrive la differenza tra i dati sperimentali e il raccordo computazionale.
Ciò dimostra che per le quattro diverse concentrazioni di colonna tre delle curve si adattano bene. Tuttavia, per la concentrazione più alta la curva non produce una buona vestibilità. Ciò suggerisce che a questa maggiore concentrazione, c'è un legame eterogeneo della colonna al perno.
Questo segnale di massima concentrazione non è quindi incluso nell'analisi cinetica come da note applicative ForteBio. Le restanti tre curve vengono utilizzate per l'analisi cinetica. Una costante di dissociazione tra FhuA e ColM, determinata utilizzando il metodo BLI e Peptidisc, è coerente con le costanti determinate con altri metodi.
La calorimetria isotermica e i nanodisci, la termoforesi su microscala e il Peptidisco hanno prodotto costanti di dissociazione non significativamente diverse dal nostro valore determinato. Questa coerenza convalida il metodo Peptidisc BLI per misurare la cinetica di interazione. Va bene, quindi, dopo aver visto questo video, speriamo che tu abbia acquisito una comprensione pratica della forza e dell'avvertenza dei metodi PeptiQuick.
Abbiamo trovato questo metodo particolarmente utile per quantificare l'interazione FhuA ColM in completa assenza di detergenti. E sospettiamo che lo stesso flusso di lavoro possa essere applicato per caratterizzare qualsiasi altra interazione recettore-ligando. Buona fortuna per i tuoi esperimenti.
