Il protocollo di ricostituzione e fusione qui dettagliato è un modo efficiente per studiare le proteine legate alla membrana in un modello di bistrato lipidico e miscelazione lipidica da parte delle proteine di fusione. Qui descriviamo una ricostituzione assistita da detergente della drosophila atlastina ricombinante, una proteina di fusione ER, in liposomi fosfatidilcolini preformati. La fusione dei proteoliposomes di atlastina viene quindi misurata da un saggio di miscelazione lipidica a base di FRET.
Uno dei principali vantaggi della ricostituzione assistita da detergenti è che la proteina nel detergente non è esposta all'essiccazione o ai solventi. Mostriamo anche qui che l'orientamento alla ricostituzione dell'atlastina è molto efficiente. Un altro vantaggio del saggio di miscelazione lipidica a base di FRET è che i liposomi non devono essere caricati con alcun colorante e non è necessario alcun passo dialisi extra.
Per iniziare questa procedura, preparare le scorte di mix lipidico in cloroformio, come delineato nel protocollo di testo. Aggiungere una microcurie per millilitro di DPPC alle miscele lipidiche, assicurandosi di riservare almeno otto microlitri di questo stock. Trasferire la quantità desiderata delle miscele lipidiche in tubi di vetro di selce.
Quindi asciugare le miscele lipidiche sotto un flusso delicato di gas azoto per circa 10 minuti fino a quando non è visibile più cloroformio. Asciugare ulteriormente il film lipidico risultante in un essiccatore aspirando per 30 minuti. Successivamente, aggiungere abbastanza A100 con 10%glicerolo, 2-mercaptoetanolo bimolare e EDTA millimolare al film lipidico per riportare la concentrazione a 10 millimolare.
Rimorsi il film lipidico vortice leggermente per 15 minuti a temperatura ambiente. Congelare i lipidi idratati in azoto liquido. Per scongelare i liposomi, lasciare riposare la soluzione a temperatura ambiente per 30 secondi, quindi trasferirli di nuovo in acqua per uno scongelamento più veloce.
Ripetere questo ciclo di congelamento-scongelamento per un totale di 10 volte. Successivamente, utilizzare un mini-estrusore per passare i lipidi attraverso filtri in policarbonato, con una dimensione dei pori di 100 nanometri, 19 volte. Per determinare la concentrazione lipidica totale dei liposomi, aggiungere quattro microlitri di stock lipidico e lisosomi a tre millilitri di cocktail a scintillazione.
Misurare i conteggi medi al minuto per stock e liposomi e calcolare la concentrazione liposoma, come delineato nel protocollo di testo. Conservare i liposomi a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. In primo luogo, mescolare la quantità appropriata di tampone, detergente extra e proteine in un tubo da 0,5 millilitri, come delineato nel protocollo di testo.
Aggiungere rapidamente i liposomi e immediatamente vortice per cinque secondi per omogeneizzare la miscela. Incubare la reazione in un nutator a quattro gradi Celsius per un'ora. Durante questa incubazione, pesare 0,2 grammi di perline adsorbenti in polistirolo e trasferirle in un tubo di microcentrifugo.
Aggiungere un millilitro di metanolo al tubo e mescolare per un minuto per degasare le perline. Quindi, aspirare il metanolo con un ago calibro 21 o superiore. Per iniziare a lavare le perline, aggiungere acqua a loro.
Lasciare mescolare le perline con l'acqua per cinque minuti, quindi aspirare l'acqua. Ripetere questo processo di lavaggio dell'acqua quattro volte. Dopo questo, aggiungere acqua per portare il liquame di perline adsorbente in polistirolo a un volume di un millilitro, con una concentrazione finale di 0,2 grammi per millilitro.
Calcolare la quantità di perline adsorbenti in polistirolo necessarie per assorbire tutto il detergente in ogni campione, come indicato nel protocollo di testo. Tagliare una punta di pipetta per raccogliere il liquame di perline. Trasferire la quantità calcolata di liquami di perline in un tubo da 0,5 millilitri e aspirare l'acqua.
Aggiungere i campioni al tubo contenente le perline e incubare in un nutator a quattro gradi Celsius per un'ora. Trasferire i campioni in un tubo fresco contenente nuove perline, assicurandosi di lasciare indietro le vecchie perline. Incubare di nuovo usando le stesse condizioni.
Ripetere questo processo di trasferimento e incubazione delle perline due volte. Successivamente, trasferire il campione in un nuovo tubo contenente perline fresche e incubare nutando durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere il campione dalle perline e dalla centrifuga a 16.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti per pellettare gli aggregati proteici insolubili.
Recuperare il supernatante e determinare la concentrazione lipidica finale mediante conteggio della scintillazione liquida, come delineato nel protocollo di testo. Per iniziare, portare il donatore e il proteoliposomes accettore a una concentrazione di 0,15 millimolari ciascuno in A100 contenente glicerolo, beta-mercaptoetanolo, EDTA e cloruro di magnesio. Trasferire ogni reazione in un pozzo in una piastra piatta da 96 po 'adatta per la lettura della fluorescenza, assicurandosi di preparare almeno quattro reazioni, tra cui un tripliceto e un controllo negativo no-GTP.
Posizionare il piatto in un lettore di piastre preriscaldato a 37 gradi Celsius. Misurare la fluorescenza NBD ogni minuto per cinque minuti. Quindi, aggiungere gtp cinque millimolare per indurre la fusione.
Misurare la fluorescenza NBD ogni minuto per un'ora usando la stessa eccitazione ed emissione di prima. Successivamente, aggiungere cinque microlitri del 2,5%n-Dodecil beta-D-maltoside ai pozzi per sciogliere i proteoliposomesmi e misurare la fluorescenza NBD massima ogni minuto per 15 minuti usando la stessa eccitazione ed emissione. In questo studio, la drosophila atlastina ricombinante viene purificata e ricostituita in liposomi preformati.
L'efficienza della ricostituzione dell'atlastina è determinata da proteoliposomes ricostituiti galleggianti in un gradiente discontinuo dello ioesolo. I campioni degli strati di gradiente superiore, centrale e inferiore vengono raccolti e analizzati mediante colorazione SDS-PAGE e Coomassie. La quantificazione del gel per densitometria mostra un'altissima efficienza di ricostituzione con perdi trascurabili, con il 96% della proteina totale trovata come proteoliposomes che galleggiava allo strato superiore.
Meno dell'1% delle proteine non è ricostituito e si trova nello strato intermedio e solo il 3% è non ricostituito o aggregato e sedimentato allo strato inferiore. L'orientamento dell'atlastina dopo la ricostituzione è quantificato da saggi di scissione trombina. I campioni vengono analizzati con colorazione SDS-PAGE e Coomassie e quantificati per densitometria.
La maggior parte della proteina ricostituita viene sciccata, con solo il 7% protetto dalla proteasi. La cinetica e l'estensione della fusione proteoliposome mediata dall'atlastina vengono analizzate mediante test di miscelazione lipidica. Un'incubazione di cinque minuti viene eseguita prima di indurre la fusione con GTP al punto di tempo zero.
Dopo un'ora, n-Dodecyl beta-D-maltoside è stato aggiunto per solubilizzare i proteoliposomes e ottenere il massimo rilascio di trasferimento di risonanza fluorescente. Il massimo di fusione in corsa è visto come l'11% della fluorescenza massima. I lipidi vengono sciolti in cloroformio.
Quando si preparano le miscele lipidiche, assicurarsi di farlo rapidamente, su una cappa chimica e sul ghiaccio per evitare qualsiasi evaporazione. È possibile analizzare i proteoliposomes atlastina per microscopia per visualizzare gli effetti di un'ancora di membrana sulla forma e sulle dimensioni liposomiche. Questo metodo è stato esteso per studiare altre proteine ancorate alla membrana e come si comporta in un modello di bistrato lipidico.
Questo protocollo utilizza lipidi titonati per quantificare le miscele lipidiche. Assicurarsi di prendere le precauzioni necessarie quando si lavora con materiali radioattivi.
