Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento della Institut Pasteur e da finanziamenti della Ligue nationale contre le Cancer (sovvenzioni R05/75-129 e RS07/75-75), l&#39;Associazione pour la Recherche sur le Cancer (borse di ARC A09 / 1/5031 e il 4867), e l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 e ANR09 MIEN 026 01). MM è stato un destinatario di una borsa di studio MENRT.

1. Lievito Screenings doppio ibrido <ol><li> Effettuare le seguenti soluzioni richieste: <ol><li> Completa Out Goccia sintetico (SD): sciogliere 26,7 g di minima base di deviazione standard con il glucosio in 1 L di acqua. Aggiungere 2 g di miscela di aminoacidi preparato come segue: 2 g hemisulfate adenina, 2 g Arginina HCl, 2 g di HCl Istidina, Isoleucina 2 g, 4 g Leucina, Lisina HCl 2 g, 2 g Metionina, Fenilalanina 3 g, 2 g L -Serina, 2 g L-treonina, 3 g Triptofano, Tirosina 2 g, 1.2 g Uracile, 9 g Valina. </li><li> Selective Cada Fuori SD-L/-W/-H: SD contenente ogni aminoacidi essenziali ad eccezione di quelli specificati (-L:-leucina;-W:-triptofano;-H:-istidina). </li><li> YPGLU: Per 1 L, peso 10 g di estratto di lievito, 10 g di Bacto peptone e 20 g di glucosio. Completo di 25 g Bacto agar per terreni solidi. </li><li> YCM: come YPGLU, ma pH regolato a 4,5. </li></ol></li><li> Accoppiamento e la diffusione <ol><li> Usare aliquote congelate di pre-trasformazionendr Y187 ceppo di lievito (tipo di accoppiamento α) che contiene una libreria di cDNA clonato in pACT2. Verificare la vitalità cellulare del placcatura diluizioni seriali su piastre SD-L. </li><li> Clonare il patogeno ORF in pGBKT7 vettore, e trasformare il plasmide ricombinante utilizzando una procedura standard in AH109 ceppo di lievito (tipo di accoppiamento a). </li><li> Diffusione pGBKT7-trasformata AH109 lievito su piastre SD-W. Incubare almeno due giorni 30 ° C in un incubatore umidificato. Piastre possono essere conservati a 4 ° C finché lo screening del doppio ibrido. </li><li> Usare 3-amminotriazolo (3-AT), un inibitore competitivo dell&#39;enzima HIS3, per contrastare il potenziale di auto-transattivazione del gene reporter HIS3 dalle proteine ​​dei patogeni. Eseguire un test di auto-attivazione determinando la concentrazione di 3-AT, che impedisce la crescita del lievito pGBKT7-trasformate su piastre SD-W/-H. </li><li> Seed 30 ml di SD-W con poche colonie di pGBKT7-trasformato AH109. Incubare 30 ore a 30 ° C con rotazione. </li><li> Seed 200 ml di SD-W con il 30 mldelle AH109 culture. Incubare con rotazione attorno 20 hr a 30 ° C. </li><li> Incubare scongelati cDNA library-Y187 trasformato in 20 ml YPGLU, incubare 10 minuti a 30 ° C con rotazione. </li><li> Centrifugare un volume di pGBKT7-trasformato AH109 cultura corrispondente ad una quantità equivalente di cellule di lievito Y187 vitali per 5 min a 3500 rpm a 20 ° C. Rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere pellet in 10 ml YPGLU. </li><li> Mescolate il lievito con risospeso AH109 Y187 biblioteca contiene. Trasferire in un tubo da 50 ml. Centrifugare per 5 min a 3500 rpm a 20 ° C, accuratamente ritirare surnatante (fragile pellet). </li><li> Risospendere il pellet in YPGLU per ottenere un totale di 1,5 ml. </li><li> Diffusione lievito a 3 YCM-Agar 150 piastre mm, 0,5 ml / piastra. Incubare 4,5 ore a 30 ° C. </li><li> Raccogliere lievito accoppiò da piastre YCM raschiando con un bicchiere rastrello in 10 ml di SD-L/-W/-H. Lavare i piatti due volte con 5 ml SD-L/-W/-H medio e piscina. </li><li> Centrifugare 5 min a 3.500 giri, 20° C. Gettare il surnatante e risospendere il lievito pellet in 5 ml SD-L/-W/-H medie. </li><li> Stendere lievito accoppiato a 10 piastre (0,5 ml / piastra) di Agar SD-L/-W/-H integrate con la concentrazione appropriata di 3-amminotriazolo (3-AT) determinato nella prova di auto-attivazione. Incubare a 30 ° C in atmosfera umidificata per 6-10 giorni. </li><li> Determinare l&#39;(2n) tasso diploide per valutare l&#39;efficienza di accoppiamento, diffondendo 250 microlitri di diluizioni seriali (10 -4 a 10 -6) della sospensione di lievito accoppiato su piastre SD-L/-W. Incubare le piastre a 30 ° C per due giorni. Contare le colonie cresciute su SD-L/-W, e dedurre il numero totale diploide presente nel volume iniziale di lievito accoppiati. Segnala questo numero diploide di vitale numero lievito biblioteca contenente per calcolare il tasso diploide. Dovrebbe variare del 10-25% circa. </li><li> 6-10 giorni dopo incubazione a 30 ° C, raccogliere colonie di lievito accoppiate in SD-L/-W/-H fresco + 3-AT piatti. [Suggerimento: per il lievito in un sistema di 8corsie di 12 pozzetti riproducenti una piastra da 96 pozzetti in modo che sia più facile per il sequenziamento seguito]. Lasciate colonie di lievito crescere per 4-5 giorni a 30 ° C in atmosfera umidificata. </li></ol></li><li> Proiezione del HIS3 cloni positivi mediante PCR e sequenziamento L&#39;obiettivo è di PCR amplificare la ORF contenuta nei pACT2 vettori di lievito colonie cresciute su piastre selettive SD-L/-H/-W. <ol><li> Mettete un piatto ben 96 PCR in ghiaccio. </li><li> Per lisare cellule di lievito, aggiungere 50 microlitri per pozzetto di una soluzione 20T Zymolase (2,5 mg / ml in 10 mM tampone HEPES pH 7.7). </li><li> Risospendere delicatamente una colonia per pozzetto. </li><li> Incubare 15 minuti a 37 ° C e 15 min a 95 ° C. </li><li> Mettere la piastra posteriore sul ghiaccio. Aggiungere 50 ml di acqua distillata per pozzetto. Mescolare bene pipettando su e giù. </li><li> Centrifugare per 5 min a 3500 rpm e 4 ° C. </li><li> PCR amplificano 10 microlitri di rilevare un inserto utilizzando primer ricottura entrambi i lati della ORF derivati ​​da cDNA in vettori pACT2. Il protocollo è gato per l&#39;amplificazione di 96 lisati colonie di lievito con la polimerasi ExTaq. Preparare la seguente miscela: 525 microlitri di buffer 10X ExTaq, 420 microlitri dNTP mix (2,5 mm), 10,5 ml Primer Forward (1 mg / mL), 10,5 ml Primer Indietro (1 mg / mL), 31,5 ml ExTaq (5 U / mL ) e 3202,5 ​​ml H 2 0. Distribuire 40 microlitri della miscela per pozzetto in una piastra PCR 96. Aggiungere 10 ml di lisato di lievito per pozzetto. Eseguire amplificazione come segue: 94 ° C per 3 min, quindi 35 cicli a 94 ° C per 30 sec, 60 ° C per 1 min, 72 ° C per 4 min, e terminano con 72 ° C per 7 minuti. Eseguire 3 pl di prodotti di PCR su un gel di agarosio 1,2% per rilevare cloni PCR-positivi. Si noti che l&#39;utilizzo di pre-fusione 96 e si raccomanda gel di agarosio. [Suggerimento: piastra può essere conservato a -20 ° C per pochi mesi e riutilizzato per la nuova PCR] </li><li> Sequenza dei frammenti di PCR amplificati isolati da HIS3 cloni positivi. Eseguire un&#39;analisi BLAST per identificare cellulare ORF. Allineamenti bassa confidenza (E Valore &amp;gt; 10 -10, identità &lt;80%, lunghezza peptide &lt;20 aminoacidi) vengono scartati e frameshifted e premature codone di STOP contenente sequenze. </li></ol></li></ol> 2. Matrix edificio per HT-GPCA HT-GPCA è un saggio basato su cellule di mammifero in cui entrambe le proteine ​​patogeno e l&#39;ospite sono transitoriamente espressi fusi a frammenti complementari della divisione Gaussia princeps luciferasi. Seguito all&#39;interazione dei partner, questo enzima viene ricostituito permettendo la misura della sua attività enzimatica. L&#39;intensità dell&#39;interazione è quindi dedotta da un Rapporto di luminescenza Normalizzato (vedi sotto e Figura 1) <ol start="4"><li> La scelta dei partner della cellula ospite <ol><li> Selezionare le proteine ​​che vengono identificati più di tre volte nelle proiezioni Y2H di ulteriore validazione in cellule di mammifero per aumentare la fiducia dei set di dati 9. </li><li> Aggiungi note partner interagenti delle proteine ​​patogeno come positive controlli. </li></ol></li><li> Trasferire in vettori compatibili HT-GPCA <ol><li> Clonare ogni agente patogeno proteina ORF in un vettore pSPICA-N2 per generare proteine ​​patogene con aminoacidi 110-185 delle umanizzati princeps Gaussia luciferasi fusi a loro N-terminale della proteina (fusioni GL2-patogeno). </li><li> PCR amplifica proteina cellulare ORF direttamente dai cloni positivi Y2H o da altre risorse ORF (umano ORFeome <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a> ) e trasferirli in vettori pSPICA-N1 per generare proteine ​​fuse all&#39;estremità N-terminale con gli amminoacidi 18-109 di umanizzato Gaussia princeps luciferasi (fusioni proteiche GL1-host). [Suggerimento: per la clonazione di grandi dimensioni, si consiglia il sistema di clonazione Gateway. In tal caso, per l&#39;amplificazione PCR, utilizzare primer disegnati per contenere siti compatibili Gateway]. </li><li> Sequenza tutti vettori di espressione. Sequenze del pSPICA-N1-N2 e pSPICApuò essere trovato in riferimento 8. </li></ol></li></ol> Si noti che i costrutti plasmidici possono essere invertiti, cioè proteine ​​agenti patogeni in pSPICA-N1 e proteina ospite in pSPICA-N2. 3. High-Throughput Gaussia princeps luciferasi-Based Protein Assay complementazione (HT-GPCA) <ol start="6"><li> Trasfezione delle cellule <ol><li> Seed 293T cellule a 350.000 cellule / ml di DMEM con 10% di siero fetale bovino (FBS) senza antibiotico. Distribuire 100 l / pozzetto in piastre di coltura sterili bianco. Non superare i 10 piatti in un singolo esperimento. Lasciate che le cellule crescono per 24 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. [Tip:. Poiché i plasmidi pSPICA contengono una origine SV40, l&#39;uso di cellule 293T permette loro replicazione in cellule trasfettate e quindi porta alla sovraespressione dei due frammenti luciferasi] </li><li> Il giorno seguente, le cellule trasfezione utilizzando qualsiasi protocollo di trasfezione adatto. Si noti che per alcuni reagenti di trasfezione, il number di cellule testa di serie può essere adattato. Utilizzare 100 ng per bene sia del patogeno e l&#39;ospite ORF costrutti plasmidici. Co-trasfezione 10 ng per pozzetto di una di CMV-lucciola luciferasi plasmide per normalizzare per efficienza di trasfezione. Ciascun punto è testato in triplicato. [Tip:. Miscele di DNA possono essere eseguite il giorno prima della transfezione e conservati a -20 ° C con guarnizioni adesive] </li><li> Trasferire miscela di trasfezione alle piastre di coltura cellule 293T. Fare attenzione a depositare dolcemente la miscela DNA sulle cellule, come 293T non sono fortemente aderente e facilmente staccare dal fondo del pozzo. Incubare in un incubatore per colture cellulare per 24-30 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li></ol><ol start="7"><li> La lisi cellulare e Gaussia dosaggio luciferasi <ol><li> Lavare le cellule con PBS (100 pl / pozzetto). Aggiungere 40 microlitri di buffer di lisi Renilla 1X. Incubare per 30 min a temperatura ambiente sotto agitazione. </li><li> Risparmia il 10 microlitri di lisato cellulare in un altro plat biancoe per successivo dosaggio dell&#39;attività di luciferasi lucciola. Conservare a 4 ° C o in alternativa a -20 ° C con tenuta. </li><li> Misurare l&#39;attività Gaussia sui rimanenti 30μl di lisati cellulari mediante l&#39;aggiunta di 100 pl di reagente di saggio luciferasi Renilla e conteggio luminescenza per 10 sec con un luminometro. Dosaggio di una piastra a 96 prende circa mezz&#39;ora. Eseguire la misurazione con estratti di cellule fresche dal congelamento o conservazione a lungo termine può influenzare l&#39;attività Gaussia interazione mediata. </li></ol></li></ol><ol start="8"><li> Misurazione dell&#39;attività Firefly <ol><li> Misurare l&#39;attività lucciola sulla salvato 10 microlitri di lisato cellulare aggiungendo 50 ml di reagente di saggio luciferasi lucciola e conteggio luminescenza per 10 sec. Dosaggio di una piastra a 96 prende circa mezz&#39;ora. [Suggerimento: Il dosaggio di lucciola luciferasi può essere eseguita il giorno dopo su lisati congelati.] </li></ol></li></ol><ol start="9"><li> Calcoli NLR <ol><li&gt; Per ogni interazione, calcolare il rapporto tra l&#39;attività di luciferasi lucciola Gaussia e attività di luciferasi per ottenere un valore normalizzato luminescenza Gaussia tenendo conto dell&#39;efficienza di transfezione e vitalità cellulare. Calcolare la media dei triplicato. </li><li> Per monitorare l&#39;interazione, stimare un rapporto di luminescenza Normalizzato (NLR) per ogni coppia patogeno-ospite. Per fare ciò, dividere il normalizzato attività luminescenza Gaussia rilevata in presenza sia patogeno e proteine ​​ospite dalla somma delle attività misurate in pozzetti di controllo (Figura 1 adattato da riferimento 8). Il valore di cut-off NLR per le interazioni positive è stato stimato in circa 3,5 8. </li></ol></li></ol><ol start="10"><li> Analisi dei dati <ol><li> Eseguire il clustering gerarchico utilizzando il pacchetto statistico R. Prima, raggruppare i dati NLR in categorie, quindi calcolare un dendrogramma un&#39;interazione con il metodo linkage completo. Visualizza questodendrogramma con JavaTreeView 10. Calcolare la distanza tra interazione dendrogramma e albero filogenetico con un coefficiente di correlazione di Pearson. </li><li> Per generare reti di interazione, selezionare le interazioni positive dal dataset HT-GPCA e utilizzare il software Cytoscape 1. Estrarre i gradi delle proteine ​​ospite e tracciare la loro distribuzione per accedere alle dinamiche locali di rete. Reti host-agenti patogeni possono essere sovrapposti alla interattoma ospite di fornire una valutazione dell&#39;impatto globale delle proteine ​​patogene nella rete cellulare host. </li><li> Estrarre il GO (Gene Ontology) termini associati con i fattori cellulari mirati con il DAVID database di bioinformatica 12 per valutare l&#39;arricchimento funzionale del dataset. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+viruses+hijack+cell+regulation.">How viruses hijack cell regulation.</a> Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).</li><li>Calderwood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+and+virus+human+protein+interaction+maps.">Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).</li><li>de Chassey, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+infection+protein+network.">Hepatitis C virus infection protein network.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 230 (2008).</li><li>Simonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactome+mapping+for+HTLV-1+and+-2+retroviruses.">Host-pathogen interactome mapping for HTLV-1 and -2 retroviruses.</a> Retrovirology. 9, 26 (2012).</li><li>Dyer, M. D., Murali, T. M., Sobral, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+human+proteins+interacting+with+viruses+and+other+pathogens.">The landscape of human proteins interacting with viruses and other pathogens.</a> PLoS Pathog. 4, e32 (2008).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437, 1173-1178 (2005).</li><li>Venkatesan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+empirical+framework+for+binary+interactome+mapping.">An empirical framework for binary interactome mapping.</a> Nat. Methods. 6, 83-90 (2009).</li><li>Cassonnet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+a+luciferase+complementation+assay+for+detecting+protein+complexes.">Benchmarking a luciferase complementation assay for detecting protein complexes.</a> Nat. Methods. 8, 990-992 (2011).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome.">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4569-4574 (2001).</li><li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data.">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20, 3246-3248 (2004).</li><li>Smoot, M. E., Ono, K., Ruscheinski, J., Wang, P. L., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoscape+2.8:+new+features+for+data+integration+and+network+visualization.">Cytoscape 2.8: new features for data integration and network visualization.</a> Bioinformatics. 27, 431-432 (2011).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions.">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).</li><li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase.">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li><li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions.">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Indipendentemente, lievito-due saggi di interazione ibridi e mammiferi, come il GST pull-down, LUMIER o MAPPIT, hanno dimostrato di essere strumenti efficaci per individuare le interazioni proteina-proteina, ma sono limitati dal tasso elevato di falsi positivi e falsi negativi interazioni associate con queste tecniche 15. Inoltre, vi è sempre maggiore che combinando metodi ortogonali aumenta l&#39;affidabilità dell&#39;interazione dataset ottenuto 7. Il recente sviluppo della tecnica HT-GPCA desc...

La crescente quantità di dati raccolti per generare mappe di interazione proteina-proteina apre prospettive per comprendere ulteriormente infezioni da patogeni. Poiché la comprensione globale di infezioni patogeno comincia ad emergere, fornisce accesso alla gamma delle perturbazioni indotte dalle proteine ​​patogeni quando si collega il proteoma umano 1. E &#39;in tal modo offre un modo per capire come gli agenti patogeni manipolano il macchinario della cellula ospite. In particolare, la mappatura delle diverse reti di interazione virus-ospite ha rivelato che le proteine ​​virali preferenzialmente proteine ​​bersaglio host che sono fortemente connessi alla rete cellulare (hub), o che sono al centro di molti percorsi in una rete (proteine ​​colli di bottiglia) 2-4. Queste interazioni consentono ai virus di manipolare importanti processi cellulari, che è strumentale per replicare e produrre progenie infettiva. Mappatura interazioni comparativi sono stati recentemente condotto sul virus collegati con l&#39;obiettivo di estrarre le informazioni relative alpatogenesi 4. Inoltre, gli studi di host-patogeni interazioni paesaggio sono stati estesi a molti agenti patogeni 5. La cella di identificazione fattori mirata fornisce approfondimenti sulle strategie utilizzate da agenti patogeni di infettare le cellule e permette di individuare i potenziali marcatori patogeni. Il sistema di doppio ibrido di lievito è il metodo più popolare per identificare interazioni binarie poiché lo screening genetico è uno strumento efficace e sensibile per la mappatura ad alta velocità di interazioni proteina-proteina. L&#39;approccio qui proposto migliora ulteriormente le singole proiezioni Y2H valutando una proteina di molteplici agenti patogeni varianti di deformazione, fornendo così accesso ad una panoramica comparativa delle interazioni proteina-proteina patogeno-ospite. Inoltre, una limitazione importante di lievito di screening del doppio ibrido giace in un alto tasso di falsi negativi, poiché recupera circa il 20% delle interazioni totale 6. Ciò implica che le interazioni rilevate con solo un sottoinsieme di patogens varianti potrebbero essere sfuggiti al rilevamento con gli altri. Pertanto, i singoli partner emergenti di tutte le proiezioni di due ibridi sono ulteriormente sfidati per l&#39;interazione con l&#39;intera gamma di ceppi studiati, fornendo serie di dati comparativi di interazione. Poiché è stato dimostrato che la combinazione di differenti metodologie fortemente aumenta la robustezza di interazione proteina-proteina set di dati 7, questa convalida viene eseguita in cellule di mammifero mediante un saggio di complementazione proteina-frammento di recente sviluppato chiamato HT-GPCA 8. Questo sistema a base di cellule permette il rilevamento di interazioni proteina dalla complementazione del Gaussia princeps diviso luciferasi ed è stato progettato per essere compatibile con un formato ad alta produttività. Grazie alla sua tecnologia di luminescenza-based e il suo basso rumore di fondo rispetto ad altre analisi basato sulla fluorescenza, HT-GPCA mostra una sorprendentemente elevata sensibilità. In generale, questo approccio costituisce un efficientestrumento per generare una mappatura completa delle interazioni ospite-patogeno, che rappresenta il primo passo verso una comprensione globale della cellula ospite dirottamento.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal SD base</td>
			<td>US biological</td>
			<td>D9500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>264571000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase</td>
			<td>Seikagaku</td>
			<td>120491</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>31966</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-wellPCR plates</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4t-i0730/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (30 &deg;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &deg;C)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>Centro XS-LB 960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comparative approach to characterize the landscape of host-pathogen protein-protein interactions

Notevoli sforzi sono stati raccolti per produrre proteina-proteina mappe di rete di interazione su larga scala globale. Questo è fondamentale per comprendere le relazioni patogeno-ospite ed è stata eseguita essenzialmente da screening genetico nei lieviti sistemi a due ibridi. Il recente miglioramento della rilevazione interazione proteina-proteina da una luciferasi-based test di complementazione frammento Gaussia offre ora l&#39;opportunità di sviluppare approcci comparativi interactomic integrativi necessari per confrontare rigorosamente profili di interazione di proteine ​​provenienti da diverse varianti di ceppo patogeno nei confronti di un insieme comune di fattori cellulari. Questo documento si concentra in particolare sulla utilità di combinare due metodi ortogonali per generare proteina-proteina set di dati di interazione: lievito di due ibridi (Y2H) e un nuovo saggio, high-throughput Gaussia princeps saggio di complementazione proteica (HT-GPCA) eseguita in cellule di mammifero. nt &quot;&gt; A identificazione su larga scala di partner cellulari di una proteina patogeno viene eseguita con l&#39;accoppiamento a base di lievito proiezioni doppio ibrido di librerie di cDNA utilizzando molteplici varianti ceppo patogeno. Un sottoinsieme di partner interagenti selezionati su un punteggio alto confidenza statistica è ulteriormente convalidato in cellule di mammifero per le interazioni pair-wise con l&#39;intero insieme di proteine ​​varianti patogeni utilizzano HT-GPCA. Questa combinazione di due metodi complementari migliora la robustezza del set di dati di interazione, e consente l&#39;esecuzione di una rigorosa analisi di interazione comparativa. Tali intergenomica comparativi costituire una strategia affidabile e potente per decifrare eventuali interazioni patogeno-ospite.

Un punto di forza di HT-GPCA risiede nella sua elevata sensibilità, come illustrato dalla valutazione di tassi positivi e falsi negativi falsi per la proteina E2 di HPV nella Figura 2 (adattato dal riferimento 13). Per determinare il tasso di falsi negativi, note interazioni di E2 da HPV16 sono state valutate da HT-GPCA (Figura 2A). Quattro su 18 interazioni non sono stati recuperati (corrispondente ad un tasso di falso negativo 22%). Le interazioni falsi positivi sono stati misurati a...

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A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Questo articolo si concentra sulla identificazione di alta fiducioso set di dati di interazione tra ospite e patogeno proteine ​​usando una combinazione dei due metodi ortogonali: lievito di doppio ibrido seguita da un saggio di interazione high-throughput in cellule di mammifero chiamato HT-GPCA.

Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

a-comparative-approach-to-characterize-landscape-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K Views.  Institut Pasteur. Questo articolo si concentra sulla identificazione di alta fiducioso set di dati di interazione tra ospite e patogeno proteine ​​usando una combinazione dei due metodi ortogonali: lievito di doppio ibrido seguita da un saggio di interazione high-throughput in cellule di mammifero chiamato HT-GPCA.

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Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to facilitate cross-presentation of chaperoned antigens and elicit innate and adaptive T cell responses. Xenopus skin graft rejection provides an excellent platform to study the ability of gp96 to elicit classical MHC class Ia (class Ia) restricted T cell responses. Additionally, the Xenopus model system also provides an attractive alternative to mice for exploring the ability of gp96 to generate responses against tumors that have down-regulated their class Ia molecules thereby escaping immune surveillance. Recently, we have developed an adoptive cell transfer assay in Xenopus clones using peritoneal leukocytes as antigen presenting cells (APCs), and shown that gp96 can prime CD8 T cell responses in vivo against minor histocompatibility skin antigens as well as against the Xenopus thymic tumor 15/0 that does not express class Ia molecules. We describe here the methodology involved to perform these assays including the elicitation, pulsing and adoptive transfer of peritoneal leukocytes, as well as the skin graft and tumor transplantation assays. Additionally we are also describing the harvesting and separation of peripheral blood leukocytes used for flow cytometry and proliferation assays which allow for further characterization of the effector populations involved in skin rejection and anti-tumor responses.

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

The frog Xenopus laevis provides an attractive alternative non-mammalian model for exploring the ability of heat shock protein such as gp96 to promote antigen-specific CD8 T cell responses. We present methods to study in vivo facilitation of cross-presentation of skin and tumor antigens by gp96.

Comparativo In vivo Studio di gp96 Adjuvanticity nella rana Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

L&#39;uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Fenomica fagi: Approcci fisiologici per caratterizzare Novel virali Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In risposta al trattamento antibiotico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infezione delle larve di zebrafish con spore di Aspergillus per l'analisi delle interazioni ospite-patogeno

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

Flusso di lavoro proteomica quantitativa senza etichette per interazioni host-patogeno guidate dalla scoperta

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...