La preparazione di antibiotici fluorescenti consente di valutare la localizzazione di questi reagenti terapeutici all'interno dei batteri attraverso comode tecniche analitiche come spettrofotometria e microscopia. Il principale vantaggio di questa tecnica è la facilità con cui è possibile determinare la localizzazione degli antibiotici. Questa localizzazione è rilevante per una serie di fenomeni tra cui efflux.
Per eseguire la procedura di reazione click A, posizionare l'antibiotico azide di interesse in un pallone inferiore rotondo e aggiungere 25 millilitri di tert-butanolo e 25 millilitri di acqua per millimolo di azide al pallone. Aggiungere l'alchine fluoroforo preparato alla soluzione e riscaldare la reazione a 50 gradi Celsius. Aggiungere quindi 0,6 equivalenti di solfato di rame e 2,4 equivalenti di acido ascorbico al pallone.
Mescolare la reazione per un'ora o fino a quando l'analisi da parte di LCMS indica il completamento della reazione. Quindi raffreddare e purificare la reazione in base alle esigenze dell'impalcatura antibiotica. Qui, viene mostrata la reazione chimica chiave del clic chiave per la preparazione di antibiotici fluorescenti con esempi della struttura sintetizzata dai corrispondenti antibiotici attraverso un intermedio azide a base di ciprofloxacina, linezolid e trimethoprim.
In queste tracce di spettrometria di massa cromatografica liquida da un azide di ciprofloxacina e una reazione di clic di alchidina NBD, l'azide è stato eluito a 3,2 minuti e il prodotto è stato eluito a 3,8 minuti. L'avanzamento della reazione del clic può essere seguito dalla scomparsa del picco di azide. In questi spettri, l'impatto della purificazione può essere visualizzato con picchi errati che scompaiono.
Per valutare l'attività antimicrobica dell'antibiotico sintetizzato, le scorte di glicerolo striato di ceppi batterici appropriate per l'impalcatura antibiotica sulle piastre di agar LB e far crescere le colture durante la notte a 37 gradi Celsius. La mattina seguente, scegli una singola colonia da ogni piatto e cultura le colonie durante la notte in cinque millilitri di CAMHB per coltura a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, diluire le colture circa 40 volte in CAMHB fresco e far crescere i batteri fino alla fase di log media con una densità ottica a 600 nanometri tra 0,4 e 0,8.
Successivamente, preparare le soluzioni stock di ogni antibiotico fluorescente a 1,28 milligrammi per millilitro nel 20% di solfossido di dimetile in acqua sterile e aggiungere 10 microlitri di antibiotico a ciascun pozzo della prima colonna di una piastra da 96 pozzetti. Aggiungere 90 microlitri di CAMHB ad ogni pozzo della prima colonna e 50 microlitri a tutti gli altri pozzi. Quindi eseguire una diluizione seriale di due volte attraverso la piastra.
Dopo aver accuratamente miscelato, diluire le colture della fase di log medio a circa una per 10 alla sesta colonia formando unità per millilitro e aggiungere 50 microlitri di ogni coltura ai pozzi di diluizione per ottenere una concentrazione finale di circa cinque volte 10 alla quinta colonia formando unità per millilitro. Quando tutti i batteri sono stati placcati, posizionare i coperchi sulle piastre e incubare le colture per 18-24 ore a 37 gradi Celsius senza tremare. Il giorno dopo, ispezionare visivamente le piastre.
La concentrazione minima di inibizione sarà la concentrazione più bassa bene senza crescita visibile. Per l'analisi dell'accumulo di sonda, scorte di glicerolo striato dei ceppi batterici sulle piastre di agar LB per un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius. La mattina dopo, scegli una singola colonia dal piatto per la coltura notturna in brodo di licogenia a 37 gradi Celsius.
La mattina dopo, diluire la cultura notturna circa 50 volte in mezzo fresco. Quando la coltura raggiunge la fase centrale del log, pelletare i batteri per centrifugazione e decantare il mezzo. Rimospendare i batteri in un millilitro di PBS e centrifugare di nuovo i batteri.
Decantare il supernatante e rimescolare il pellet lavato in PBS ad una densità ottica a 600 nanometri di due. Aggiungere 10,1 microlitri di CCCP da 10 millimolari in PBS a un millilitro di batteri e incubare i batteri a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Al termine dell'incubazione, raccogliere i batteri mediante centrifugazione e rimorsi il pellet in un millilitro di soluzione antibiotica fluorescente da 10 a 100 micromolare in PBS.
Dopo un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius, lavare le cellule per centrifugazione quattro volte in un millilitro di PBS freddo per lavaggio. Dopo il lavaggio, lyse i batteri con 180 microlitri di tampone dilisi e 70 microlitri di glisozima. Dopo 30 minuti a 37 gradi Celsius, congelare-scongelare i batteri tre volte a meno 78 gradi Celsius per cinque minuti e 34 gradi Celsius rispettivamente per 15 minuti.
Dopo l'ultimo ciclo di congelamento-scongelamento, sonicare il campione per 20 minuti seguito da un'incubazione di 30 minuti a 65 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, raccogliere il campione lisciviato mediante centrifugazione e filtrare il contenuto del tubo attraverso una membrana filtrante da 10 kilodalton. Lavare il filtro quattro volte con 100 microlitri d'acqua per lavaggio e aliquota ciascuno lavare in singoli pozzi di un fondo piatto nero piatto piastra 96-ben piastra.
Quindi misurare l'intensità della fluorescenza su un lettore di piastre con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate al fluoroforo. Questi risultati tipici della valutazione dell'accumulo intracellulare mediante spettroscopia a fluorescenza in presenza e assenza di efflusso mostrano che la fluorescenza intracellulare dei batteri è significativamente più elevata dopo il pretrattamento con CCCP indicando che l'efflux riduce l'accumulo all'interno dei batteri. In queste immagini rappresentative di microscopia confocale di batteri Gram positivi e Gram negativi, la localizzazione dell'antibiotico all'interno dei batteri può essere visualizzata dopo il trattamento CCCP.
Questo fenomeno non si osserva quando non viene aggiunto cccp. Quando si utilizzano antibiotici fluorescenti, tenere presente quali informazioni si stanno cercando di raccogliere ed essere sicuri di considerare quale protocollo sarà più utile quando si ottengono questi dati. Dopo la loro sintesi, gli antibiotici fluorescenti possono essere utilizzati per studiare una serie di processi batterici tra cui interazioni farmacologiche e modifiche della resistenza.
