Il nostro protocollo fornisce un processo chiaro per studiare gli effetti neurocomportamentali delle sostanze e degli inquinanti di interesse sulle larve di zebrafish e per rivelare la potenziale neurotossicità di questi agenti. La tecnica può essere eseguita utilizzando test ad alta produttività dei neurocomportamenti nel modello zebrafish. Questo metodo può essere applicato per valutare gli effetti allele-neurocomportamentali degli inquinanti per dimostrare una potenziale neurotossicità su di noi esseri umani, poiché il genoma del pesce zebra ha un'alta omologia con l'uomo, in modo da poter fornire indicazioni per la gestione chimica e i problemi di salute pubblica causati dagli inquinanti.
Poiché zebrafish ha il vantaggio dello screening ad alta produttività, questo metodo fornisce informazioni sia sullo sviluppo di farmaci psicotropi che sulla ricerca tossicologica ambientale. Non farti intimidire dallo studio del primo esperimento. Se segui il protocollo, esito positivo.
Almeno due ore prima di eseguire un esperimento, impostare la temperatura ambiente a 28 gradi Celsius e aggiungere 800 microlitri di soluzione di esposizione a ciascun pozzo di una micropiatta da 48 porri. Quindi, utilizzare una pipetta da un millilitro con una punta modificata per trasferire una larva in 200 microlitri di soluzione di esposizione ad ogni pozzo della micropiatta in preparazione per un esperimento di locomozione e angolo del percorso. Per preparare una micropiatta a sei porri per esperimenti di comportamento sociale, aggiungere quattro millilitri di soluzione di esposizione a ciascun pozzo della micropiatta dei sei pozzi e trasferire due larve in 200 microlitri di soluzione di esposizione ad ogni pozzo.
Prima di iniziare il test, aprire il programma software di monitoraggio ad alta velocità effettiva e selezionare il modulo degli angoli del percorso delle rotazioni di tracciamento. Trasferire la micropiastra da 48 punti sulla piattaforma di registrazione e tirare giù il coperchio. Fate clic su File e genera protocollo (Generate Protocol) per iniziare a generare un nuovo protocollo e immettete 48 nella posizione Conteggio posizione (Location count).
Fare clic su Parametri, Parametri protocollo e Tempo, impostare la durata dell'esperimento su un'ora e 10 minuti e il periodo di integrazione su 60 secondi. Utilizzando lo strumento forma ellittica, disegnare bene un cerchio intorno all'alto a sinistra. Selezionare il cerchio e fare clic su Copia, Segna in alto a destra, Incolla e Seleziona.
Usare il mouse per trascinare bene il cerchio copiato in alto a destra e fare clic su Copia, Segna in alto a destra, Incolla e Seleziona di nuovo. Trascinare quindi bene il cerchio copiato in basso a destra e fare clic su Genera e cancella segni. Il sistema disegnerà automaticamente un cerchio su ogni altro pozzo della piastra.
Fare quindi clic su Disegna scala e disegnare una linea di calibrazione sullo schermo. Immettere la lunghezza della linea, impostare l'unità e fare clic su Applica al gruppo. Impostare il colore animale su nero e impostare la soglia di rilevamento su 16 a 18 per consentire il rilevamento degli animali, impostare l'inattivo a piccola velocità su 0,5 centimetri al secondo e la velocità da piccola a grande a 2,5 centimetri al secondo.
Impostare le classi dell'angolo del tracciato da meno 180 a più 180 come indicato. Per impostare le condizioni di luce, fare clic su Parametri, Guida leggera, Utilizza uno dei 3 metodi di attivazione riportati di seguito e Stimoli avanzati per impostare le condizioni di luce. Fate clic su Bordo (Edge) e impostate un periodo buio di 10 minuti, seguito da tre cicli di periodi alternati di luce e buio di 10 minuti.
Quindi, salva il protocollo. Una volta impostati tutti i parametri, abbassare l'illuminazione nella sala prove e consentire alle larve di acclimatarsi nel sistema per 10 minuti. Al termine del periodo di acclimatazione, fate clic su Esperimento (Experiment) ed Esegui (Execute) e create la cartella in cui devono essere salvati i file sperimentali.
Quindi, immettere il nome del risultato e fare clic su Sfondo e Start. Al termine dell'esperimento, fate clic su Esperimento (Experiment) e Interrompi (Stop). Quindi riportare la micropiatta da 48 pozzi all'incubatore di luce per esperimenti successivi.
Poiché ogni gruppo può includere 16 animali, il sistema può essere utilizzato per eseguire test ad alta produttività della locomozione e dell'angolo del percorso in diverse condizioni di trattamento in un'unica micropiatta da 48 porri. L'attività sociale delle larve può essere testata utilizzando piastre a sei pozzi. In questo esperimento rappresentativo, il gruppo di concentrazione più elevato del BDE-47 ha dimostrato una pronunciata ipoattività durante il periodo buio, mentre non sono stati osservati cambiamenti dovuti all'esposizione al BDE-47 durante i periodi di luce.
Inoltre, il gruppo ad alta concentrazione di 6-idrossi-BDE-47 ha eseguito meno giri di routine e medi a cinque giorni dopo la fecondazione. Tuttavia, sono state indotte curve più reattive nei gruppi di esposizione 6-metossi-BDE47. L'attività sociale del pesce zebra è stata stimolata dalla paraffina clorurata-70 e dalla paraffina clorurata a catena corta-52b, mentre la paraffina clorinata a catena lunga-52a ha accorciato la durata per il contatto delle larve.
È importante assicurarsi che le larve trasferite per il test abbiano una normale capacità di nuoto e nessuna malformazione. Altre variabili, come la preferenza del colore, la preferenza chiaro-scuro, tutte le tenebre, i movimenti della coda del pesce zebra, possono essere incluse per rispondere ad ulteriori domande sulla tossicità neurocomportamentale degli inquinanti ambientali. Le soluzioni di esposizione BDE-47 sono neurotossiche e hanno un potenziale di alterazione endocrina, quindi assicurati di evitare il contatto diretto con la pelle.
