Il nuovo saggio del serbatoio si combinerà con potenti strumenti genetici in Zebrafish offre un metodo per sezionare come il cervello modula lo stress e come i circuiti neurali possono essere disregolati. Le vie di segnalazione genetica e neuronale sono altamente conservate tra Zebrafish e mammiferi e questa tecnica può aiutare a promuovere la nostra comprensione dei meccanismi alla base della risposta allo stress. Il metodo non è specifico di Zebrafish ed è stato utilizzato con il pesce grotta cieco messicano e quindi può potenzialmente essere esteso ad altre specie ittiche.
Una prova può essere utile per determinare un'illuminazione corretta e il contrasto dell'animale su uno sfondo per ottenere un tracciamento riuscito. Il saggio viene usato raramente, ma può essere un processo coinvolto. La visualizzazione dei passaggi aiuterà altri ricercatori a eseguire correttamente la procedura.
Jacqueline Chin, un post-doc in laboratorio, e Lydia Albert, una studentessa universitaria, presenteranno questa procedura. Inizia riempiendo un becher da 250 millilitri e almeno due serbatoi di detenzione con acqua del sistema di pesci. La mattina del test, trasferire almeno 10 Zebrafish adulti per ogni condizione sperimentale in singoli serbatoi di detenzione prima di trasferire tutto il pesce nella Behavior Room per l'acclimatazione per almeno un'ora.
Etichettare i serbatoi in modo che la condizione o il genotipo degli animali sia cieco allo sperimentatore e utilizzare una rete per posizionare delicatamente un singolo adulto nel becher preriempato. Lasciare che il pesce adulto si acclimati nel becher per 10 minuti prima di versare delicatamente l'acqua e il pesce dal becher nel nuovo serbatoio sperimentale. Non appena il pesce è nel serbatoio, inizia la registrazione della fotocamera e allontanati dalla configurazione per evitare ulteriori disagi al pesce.
Al termine della registrazione, rimuovere l'individuo dal nuovo serbatoio e posizionare il pesce in un nuovo serbatoio di attesa. Per valutare gli effetti di specifici farmaci di interesse, diluire il farmaco a una concentrazione di lavoro in becher da 250 millilitri di acqua di sistema. Utilizzo di un becher con acqua di sistema solo come controllo.
Mascherare l'identità del farmaco e controllare i becher per garantire che il tester sia cieco alle condizioni di trattamento fino a dopo l'analisi ed eseguire un nuovo test del serbatoio come dimostrato per ottenere una risposta allo stress comportamentale di base. Al termine della registrazione di base, utilizzare una rete per trasferire immediatamente il pesce in uno dei becher di prova per 10 minuti prima di trasferire il pesce in un bicchiere di lavaggio contenente solo acqua dolce del sistema. È importante utilizzare reti separate designate per ogni becher di trattamento per prevenire il dosamento accidentale del pesce di controllo, specialmente quando sono coinvolti diversi trattamenti farmacologici.
Dopo 10 minuti, metti il pesce in un nuovo serbatoio per un secondo nuovo test del serbatoio. Al termine del test trasferire il zebrafish adulto in un nuovo serbatoio di detenzione e sostituire l'acqua del sistema nel secondo nuovo serbatoio con acqua di sistema fresca per il passaggio successivo per prevenire la contaminazione incrociata del farmaco sperimentale. Alla fine di tutte le prove, riportare gli individui alla struttura ittico.
Qui viene mostrata l'attività locomotoria di un singolo Zebrafish durante il primo e l'ultimo minuto di una nuova prova del serbatoio di 10 minuti. Quando viene introdotto per la prima volta nel serbatoio, il pesce in genere trascorre la maggior parte del tempo nel fondo del nuovo serbatoio. Nel corso del tempo, tuttavia, i pesci adulti dimostrano un graduale aumento della quantità di tempo trascorso nella parte superiore del serbatoio.
In effetti, il tempo totale trascorso nella parte superiore del serbatoio durante il primo minuto è significativamente più breve rispetto all'ultimo minuto del nuovo test del serbatoio. Al contrario, la distanza totale percorsa tra il primo e l'ultimo minuto non rivela differenze significative. In questo esperimento rappresentativo, l'analisi dei percorsi locomotori zebrafish adulti ha rivelato poca differenza tra l'attività di nuoto Zebrafish prima e dopo il trattamento per gruppi di adulti esposti al solo veicolo.
Al contrario, gli adulti esposti a un farmaco ansiolitico hanno trascorso una grande quantità di tempo nella parte superiore del serbatoio rispetto ai percorsi locomotori dello stesso pesce prima dell'esposizione al farmaco. Queste differenze non erano dovute a una minore locomozione in generale, in quanto non sono state misurate differenze significative nella distanza percorsa per nessuno dei gruppi. Poiché i ritmi comportamentali sono influenzati dai processi circadiani, assicurati di eseguire repliche sperimentali eseguite in giorni diversi durante la stessa ora del giorno per ogni esperimento.
Ulteriori test comportamentali, come il test sul campo aperto o altre misurazioni fisiologiche dello stress, possono essere eseguiti per convalidare ulteriormente i risultati ottenuti dal nuovo test di immersione in vasca. Questo metodo può essere utilizzato un saggio ad alta produttività per affrontare le domande relative allo stress, alla paura e all'ansia.
