L'analisi dei peptidi endogeni, che sono più piccoli della maggior parte delle proteine, ma più grandi di molti peptidi digeriti è un campo sotto esame. Questo protocollo affronta lo scap nei flussi di lavoro basati sulla spettrometria di massa. La spettrometria di massa è altamente sensibile e può essere utilizzata per colpire specifici neuropeptidi di interesse o può catturare e rilevare una gamma di neuropeptidi all'interno di un campione.
La quantificazione e la localizzazione dell'espressione di neuropeptidi mediante spettrometria di massa può portare allo sviluppo di terapie peptidiche e alla scoperta di biomarcatori neuropeptidici per varie malattie. Per iniziare l'estrazione del neuropeptide raccogliere il tessuto cerebrale dal crostaceo e utilizzando una pinza posizionare immediatamente un tessuto ciascuno in un tubo da 0,6 millilitri contenente 20 microlitri di metanolo acidificato. Aggiungere 150 microlitri di metanolo acidificato al campione.
Impostare il tempo totale del paziente Sonic su 24 secondi, il tempo di impulso su otto secondi. Mettere in pausa il tempo a 15 secondi un'ampiezza al 50% su un omogeneizzatore ad ultrasuoni e omogeneizzare i campioni sul ghiaccio. Centrifugare il campione a quattro gradi Celsius a 20.000 GS per 20 minuti.
Con una pipetta trasferire il surnatante in un tubo e asciugarlo in un concentratore di vuoto a circa 35 gradi Celsius. Per la desalinizzazione ricostituire il campione di tessuto estratto in 20 microlitri di acido formico allo 0,1%. Vortice la soluzione e sonicare in un bagno d'acqua a temperatura ambiente per un minuto.
Applicare 0,5 microlitri di campione su una striscia di pH per confermare che il pH è inferiore a quattro. Centrifugare a quattro gradi Celsius e 20.000 GS per 30 secondi. Preparare il lavaggio di equilibratura bagnante in soluzioni di illusione.
Ottenere una punta di desalinizzazione da 10 microlitri con resina C18. Posizionare la punta di dissalazione su una pipetta da 20 microlitri impostata su 15 microlitri. Aspirare la punta tre volte con la soluzione bagnante e tre volte con la soluzione di collaborazione equi.
Aspirare nel campione 10 volte seguito da lavare tre volte in soluzione di lavaggio scartando ogni lavaggio. Eluire aspirando 10 volte in ciascuna delle soluzioni di illusione in ordine di aumentare l'acetonitrile. Asciugare i neuropeptidi allusi in un concentratore a vuoto.
Ricostituire i neuropeptidi essiccati dissalati in cinque microlitri di acido formico allo 0,1%. Vortice la soluzione e sonicarla a bagnomaria a temperatura ambiente per un minuto. Centrifuga brevemente a 2000 GS. Per individuare neuropeptidi e tessuti crostali, pipettare una goccia di tre microliti di campione su un film idrofobo.
Pipettare tre microlitri di matrice DHB direttamente sulla goccia campione. Mescolare le soluzioni pipettando su e giù. Pipettare un microlitro della miscela di campioni e matrici in un pozzetto della piastra target in acciaio inossidabile MALDI e utilizzare la punta della pipetta per distribuire ogni miscela ai bordi del pozzo del campione.
Individuare un microlitro di calibro uno-a-uno e una miscela di matrice in un pozzo vicino al campione. Inserire la piastra bersaglio contenente punti campione essiccati nello strumento MALDI tandem time-of-flight. Con la matrice DHB impostata la potenza laser al 95% Seleziona il guadagno ottimale automatico del rilevatore e la modalità di movimento intelligente completa del portacampione.
Acquisire MS Spectra nell'intervallo da 200 a 3, 200 M su Z e aggiungere più spettri da ogni punto insieme per aumentare il rapporto segnale neuropeptide / rumore. Riempire mezza tazza di criostato con gelatina e lasciarla solidificare a temperatura ambiente. Tenere al caldo la gelatina liquida rimanente a bagnomaria a 37 gradi Celsius.
Raccogliere il tessuto neuronale desiderato dall'animale e utilizzare una pinza per immergere immediatamente il tessuto in un tubo da 0,6 millilitri contenente acqua deionizzata per un secondo. Posizionare il tessuto sopra la gelatina solida e riempire il resto della tazza di criostato con gelatina liquida. Utilizzare una pinza per posizionare il tessuto.
Posizionare la tazza criostato su una superficie piana e congelare con ghiaccio secco. Per la preparazione del sezionamento separare il campione incorporato di gelatina dallo stampo criostato tagliando via lo stampo. Montare il tessuto incorporato su un mandrino criostato pipettando una goccia di acqua deionizzata da un millilitro sul mandrino e premendo immediatamente il tessuto incorporato sulla goccia.
Una volta congelata la pipetta, più acqua deionizzata intorno al tessuto per fissarlo ulteriormente al mandrino. Sezionare il tessuto ad uno spessore approssimativo di una cellula. Montare con il pollice ogni sezione su un vetrino rivestito con ossido di indio stagno posizionando un lato della diapositiva vicino alla sezione e posizionando un dito sull'altro lato della diapositiva per riscaldare lentamente il vetro e consentire alla sezione di aderire alla diapositiva.
Esporta De Novo solo peptidi. CSV da picchi con un punteggio medio di confidenza locale maggiore o uguale a 75. Cerca nell'elenco dei peptidi motivi di sequenza noti indicativi di neuropeptidi appartenenti a specifiche famiglie di neuropeptidi.
Scegli una sequenza nota di aminoacidi ormonali pre-pro di interesse e usa TB blast N per cercare query pre-pro sequenza ormonale contro un database. Selezionare l'organismo bersaglio e modificare i parametri dell'algoritmo di soglia prevista a 1000 per includere allineamenti a punteggio basso. Esegui il programma blast e quindi controlla i risultati per punteggi di omologia elevati tra sequenze di query e soggetti che producono allineamenti significativi.
Salvare il file FASTA contenente la sequenza nucleotidica. Traduci la sequenza nucleotidica ormonale pre-pro in sequenze peptidiche ormonali pre-pro usando lo strumento di traduzione Expasy. Per callinectes sapidus selezionare mitocondriale invertebrato per il codice genetico ed eseguire lo strumento.
Controllare la sequenza peptidica del segnale e i siti di scissione dell'ormone pro nelle sequenze peptidiche utilizzando il segnale P.Questo è uno spettro di frammentazione di un neuropeptide identificato con una copertura della sequenza del 100% in un errore di massa del frammento basso con un limite massimo di 0,02 Dalton. Ecco uno spettro di un neuropeptide identificato anche con una copertura di sequenza al 100%, ma con un basso numero di ioni frammento, quindi la fiducia dell'identificazione è bassa. Questi sono i cromatogrammi ionici estratti per un singolo neuropeptide che è stato identificato in due cicli separati e consecutivi.
Anche se il tempo di ritenzione differisce leggermente, questo può ancora essere utilizzato per la quantificazione senza etichetta perché lo spostamento temporale è inferiore a un minuto. Questo è un esempio di uno spettro di massa a scansione completa contenente un neuropeptide che è stato marcato con Dimetile con conseguente spostamento di massa di Dalton 4.025 tra le forme leggere e pesanti del neuropeptide. Lo spettro di massa ionica del frammento di un peptide sequenziato De Novo dimostra una buona copertura di frammentazione, dove lo ione frammento B e/o Y è stato osservato per ogni amminoacido con un errore di massa basso di 0,02 Dalton.
Ciò indica che è stato osservato un peptide endogeno appartenente alla famiglia dei neuropeptidi RYMI dei crostacei. Esempi di buoni punti che toccano tutti i bordi dell'incisione del pozzo sono mostrati a sinistra. E esempi di punti negativi sono mostrati sulla destra.
Dopo l'imaging MALDI MS di neuropeptidi da tessuti callinectes sapidus, sono state ottenute immagini di distribuzione ionica di vari valori M su Z corrispondenti a diversi neuropeptidi. L'ottimizzazione del solvente da estrazione per un particolare tipo di analy è fondamentale. Assicurarsi inoltre che si verifichi una completa omogeneizzazione e regolare il metodo secondo necessità.
Nulla verrà rilevato a valle se non viene estratto. Questa tecnica può fornire un elenco fondamentale di importanti neuropeptidi che possono essere ulteriormente studiati come potenziali biomarcatori, oltre a fornire informazioni di localizzazione non mirate senza la necessità di anticorpi.
