L'uso dell'espressione tessuto-specifica di reporter fluorescente poliglutamina in C.elegans è significativo perché consente la scoperta e la caratterizzazione di regolatori di proteostasi nel contesto di un organismo multicellulare intatto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la visualizzazione e la quantificazione del declino associato all'età della proteostasi cellulare in vivo, che è essenziale per ottenere una visione meccanicistica più profonda di come gli organismi mantengono il corretto ripiegamento e la funzione del proteoma e gli effetti dell'invecchiamento. Chiarire meccanismi in grado di preservare la proteostasi faciliterà lo sviluppo di interventi mirati per il trattamento delle malattie associate all'invecchiamento in cui la proteostasi è compromessa e per promuovere un invecchiamento sano.
Il collasso della proteostasi è un enorme problema clinico, in quanto è alla base dello sviluppo di malattie da misfolding proteico, tra cui Alzheimer, Parkinson, malattia di Huntington e sclerosi laterale amiotrofica. Inizia usando piastre di Petri da 6 centimetri di diametro per preparare cinque piastre di agar per ogni condizione di prova. Per gli esperimenti con RNAi, indurre la produzione di dsRNA in HT115 E.coli trasformato e utilizzare RNAi agar.
Utilizzare OP50 E.coli su agar NGM standard per esperimenti senza RNAi. Coltivare le colture di E.coli durante la notte a 37 gradi Celsius mentre si scuote a 220 RPM. Il giorno successivo, pellettiamo i batteri per centrifugazione a 2.400 G per 15-20 minuti, quindi aspirare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet in un decimo del volume iniziale di lb.
Aliquota 200 microlitri di batteri concentrati su ogni piastra e lasciare asciugare le piastre aperte in un ambiente pulito fino a quando tutto il liquido non è stato assorbito. Per sincronizzare i C.Elegans con il trattamento con ipoclorito, lavare due volte gli ermafroditi gravidi con tampone M9, quindi trasferirli in un tubo fresco e incubare in 5 millilitri di soluzione di ipoclorito per cinque minuti, agitandoli ogni minuto. Dopo l'incubazione, girare verso il basso gli animali e lavarli tre volte con il tampone M9.
Permettere agli embrioni di schiudersi in tubi durante la notte in 3 millilitri di soluzione M9 con rotazione a 20 gradi Celsius. Calcola la densità degli animali L1 facendo cadere 10 microlitri di soluzione L1 tre volte su una piastra di 6 centimetri e contando il numero di animali L1. Periodicamente, mescolare le soluzioni L1 per evitare che gli animali si depositino.
Semina 50 L1 un animale su ogni piatto, conta e registra il numero di semi e sposta le piastre in un incubatore a 20 gradi Celsius. In alternativa, per sincronizzare gli animali tramite la deposizione delle uova, posizionare da cinque a dieci giovani animali adulti gravidi su ciascun piatto per quattro-sei ore e consentire loro di depostare le uova fino a quando non ci sono circa 50 uova per piatto. Rimuovere tutti gli adulti gravidi e spostare le piastre con le uova in un'incubatrice a 20 gradi Celsius.
Far crescere gli animali fino allo stadio L4, che richiederà circa 40 ore a 20 gradi Celsius. Quindi aggiungere 50 microlitri di 160 volte FUDR. Per misurare il declino della proteostasi nel tessuto muscolare, scegli 20 animali e montali su un vetrino per microscopio con un tampone di agarose al 3% e una goccia di 5 microlitri di 10 millimolari di azide di sodio.
Dopo che tutti i vermi sono immobilizzati, immagina tutti i corpi degli animali usando una lente di ingrandimento 10 X. Utilizzare un filtro FITC o YFP e la stessa esposizione per ogni animale. Al termine, scartare le diapositive.
Conta il numero di fuochi nei muscoli della parete corporea dell'intero animale. I fuochi sono segnali punteggiati più luminosi che possono essere differenziati dal segnale solubile dimmer sullo sfondo. Nei giorni di punteggio, guarda le piastre con gli animali e registra il numero di animali paralizzati, quindi rimuovi gli animali paralizzati dal piatto.
Al completamento dell'esperimento, calcolare il tasso di paralisi per ogni condizione e tracciare la progressione della paralisi. Per misurare il declino della proteostasi nel tessuto neuronale, montare i vermi su un vetrino come descritto in precedenza e scattare immagini Z stack della testa degli animali su un microscopio composto utilizzando una lente di ingrandimento 40 X. Scartare le diapositive dopo l'imaging.
Dopo aver acquisito le immagini, appiattire le pile Z e utilizzarle per quantificare il numero di focolai nei neuroni situati nell'area dell'anello nervoso. Traccia la progressione dell'accumulo di focolai YFP dai giorni 4, 6, 8 e 10. Il secondo giorno dell'età adulta, scegli 10 animali sincronizzati dalla piastra e posizionali su una goccia di 10 microliti di tampone M9 su un vetrino del microscopio.
Ripeti questo passaggio almeno quattro volte per ottenere un campione di 40 o più animali. Il video registra il movimento degli animali per un periodo di 30 secondi su uno stereomicroscopio con una videocamera capace. Una volta registrati tutti i video con gli animali da analizzare, riproduci il video e segna le curve del corpo di ciascun animale.
Traccia il numero di piegature del corpo per ogni animale in un grafico a colonne, dove ogni punto rappresenta il numero di piegature del corpo in 30 secondi sull'asse Y e le diverse condizioni testate sull'asse X. Il modello di ripetizione della poliglotamina è stato determinante per l'identificazione dei geni che regolano la rete proteostatica. L'espressione di polyQ-YFP muscolo-specifica provoca l'accumulo di focolai fluorescenti che sono facili da quantificare sotto un semplice microscopio fluorescente di dissezione.
Gli animali diventano paralizzati durante la mezza età, poiché il proteoma all'interno del muscolo collassa a causa dell'effetto proteotossico del reporter. Il declino associato all'età della proteostasi neuronale può essere seguito quantificando direttamente la formazione aggregata e il declino delle curve coordinate del corpo dopo aver messo gli animali in liquido. Questo metodo è stato utilizzato per dimostrare che la proteina chinasi interagente del dominio omeo, un cofattore trascrizionale, influenza la proteostasi durante l'invecchiamento regolando l'espressione di autofagia e chaperoni molecolari.
La perdita di HPK-1 aumenta il numero di aggregati Q35-YFP che si accumulano durante l'invecchiamento. Gli animali di controllo hanno mostrato una media di 18 aggregati, mentre gli animali trattati con HPK1 null mutant e HPK1 RNAi hanno mostrato una media di 28 e 26 aggregati, rispettivamente. All'ottavo giorno dell'età adulta, dal 77 al 78% degli animali carenti di HPK1 erano paralizzati, rispetto al solo 50% del controllo.
Inoltre, è stato dimostrato che la sovraespressione di HPK1 regola la formazione di aggregati proteici e protegge gli animali che invecchiano dalla paralisi associata a Q35-YFP durante l'invecchiamento. Questo metodo misura il declino generale del proteoma all'interno di un tipo di cellula. Esistono molti metodi per valutare i cambiamenti in componenti specifici della rete prostatica.
Insieme, forniscono un quadro completo. La proteostasi in declino è un segno distintivo dell'invecchiamento. Questo approccio consente ai ricercatori di quantificare questo declino.
Se combinato con l'analisi genetica, è un potente strumento per la scoperta.
