Il tasso di sintesi proteica è perturbato durante la malattia e l'invecchiamento. Il recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching, o FRAP, consente la misurazione del tasso di sintesi proteica in vivo. Usiamo vermi C.elegans trasparenti, che esprimono GFP, come modello per monitorare la nuova sintesi proteica dopo il fotobleaching.
Forniamo linee guida pratiche per misurare il recupero della fluorescenza utilizzando vermi transgenici, che esprimono GFP sotto diversi promotori, ampiamente espressi o in cellule o tessuti specifici. Inoltre, questo metodo offre il monitoraggio della velocità di sintesi proteica in tempo reale. Utilizzare uno stereomicroscopio sezionato per valutare gli stadi di sviluppo e la crescita dei nematodi transgenici di tipo selvaggio e mutante.
Scegli 10 larve L4 di animali transgenici di tipo selvaggio e mutante che trasportano il reporter fluorescente desiderato su piastre di supporto per la crescita del nematode sementi con E.coli. Incubare e far crescere i nematodi alla temperatura standard di 20 gradi Celsius. Quattro giorni dopo, la piastra contiene una popolazione mista di vermi transgenici.
Selezionare e trasferire 15 larve L4 di ogni ceppo su piastre OP50 NGM appena sementi. Esegui il test FRAP e monitora il tasso di sintesi proteica il primo giorno di età adulta. Il giorno successivo, preparare e utilizzare piastre NGM contenenti cicloeximide come controllo positivo.
Uccidi i batteri esponendo le piastre NGM sementi per 15 minuti con luce UV. Aggiungere il cicloeximide sulla parte superiore delle piastre semibatteriche troppo 500 microgrammi per mL di concentrazione finale nel volume dell'agar. Lasciare asciugare i piatti.
Trasferire nematodi transgenici che esprimono FPG su piastre contenenti veicoli e cicloeximidi. Incubare gli animali per due ore alla temperatura standard di 20 gradi Celsius. Raccogli e trasferisci animali transgenici adulti di un giorno su singoli piatti NGM seminati con una goccia OP50 da 20 microlitri al centro.
Rimuovere il coperchio e posizionare ogni piastra sotto una lente obiettivo 20H di un microscopio epifluorescente. Mettere a fuoco e acquisire un'immagine di riferimento prima della fotobleaching. Fotobleach ogni campione per 10 minuti.
Acquisire un'immagine dopo la fotobleaching. Tieni gli animali nei singoli piatti NGM e lasciali recuperare. Immagine e registrare il recupero di ogni reporter fluorescente ogni ora per almeno sei ore in uno stereomicroscopio epifluorescente.
Preparare pastiglie di agarosio al 2% e aggiungere 10 microlitri di tampone M9 al centro del tampone di agarosio. Trasferire cinque nematodi transgenici che esprimono GFP citoplasmatica pan neuronale in una goccia di tampone M9. Utilizzare una ciglia per stendere il liquido.
Gli animali mostrano movimenti ridotti entro due minuti a causa dell'assorbanza M9 nell'agar. Cambia la posizione del nematode usando un piccone per ciglia. Posizionare il campione alla lente obiettivo 40H di un microscopio epifluorescente senza utilizzare uno slittamento di copertura.
Mettere a fuoco e acquisire un'immagine di riferimento. Fotoliach un'area di interesse mirata per 90 secondi. Acquisire un'immagine dopo la fotobleaching.
Aggiungere una goccia di 10 microlitri di tampone M9 sui nematodi fotoliciati. Lascia che gli animali si riprendano per cinque minuti. Utilizzare il piccone per ciglia o una pipetta per trasferire i nematodi su singoli piatti NGM seminati con 20 microlitri OP50 cadere al centro.
Cattura un'immagine di ogni campione ogni ora sotto uno stereomicroscopio epifluorescente. Vermi mutanti di tipo selvatico e fe-2 che esprimono GFP citoplasmatica attraverso i loro tessuti somatici usando il promotore fe-2 sono stati confrontati prima, immediatamente dopo il fotobleaching, e cinque ore dopo il recupero. Gli animali di tipo selvatico si ripresero completamente mentre i mutanti fe-2 avevano la capacità di recupero del minis.
Così i vermi di tipo selvatico iniziano la normale sintesi proteica dopo il fotobleaching, mentre i vermi privi di fattore di iniziazione alla traduzione dell'mRNA fe-2 non sono in grado di farlo, indicando che il tasso di recupero fluorescente illustra il tasso di sintesi proteica in vivo. Il cicloeximide, uno specifico inibitore della traduzione dell'mRNA può essere usato come controllo positivo per l'inibizione della traslazione proteica. Infatti, gli animali transgenici trattati con cicloeximide che esprimono FPG citoplasmatica sotto il promotore non recuperano la loro fluorescenza al momento del fotobleaching.
I corpi di elaborazione dell'mRNA influenzano il tasso di traduzione delle proteine. Nematodi mutanti di tipo selvaggio ed edc-3 che esprimono GFP pan-neuronalmente sono stati esaminati per la loro capacità di recupero al fotoblema mirato nella regione della testa. Il recupero fluorescente è molto più lento negli animali carenti di edc-3 rispetto ai vermi di tipo selvatico.
La modulazione di sintesi proteica è essenziale per l'omeostasi organismica. Durante l'invecchiamento, la sintesi proteica globale e specifica viene perturbata. Il bilanciamento della traduzione proteica controlla direttamente la senescenza e l'invecchiamento.
In particolare, i componenti principali dei macchinari di traduzione e i componenti interagenti del corpo P accelerano il processo di invecchiamento. La perturbazione dell'iniziazione alla traduzione rallenta l'invecchiamento. Quindi, misurare i tassi di sintesi proteica globale da parte di FRAP è una lettura diretta del processo di invecchiamento.
