Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione United Soybean Board 1940-352-0701-C e dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti \ Forest Service. Apprezziamo il supporto e le informazioni dettagliate di Phil Humphrey di AES.

1. Preparazione dei substrati
<ol><li>Utilizzare una superficie del substrato adatta all'applicazione. Per il legno, utilizzare un'impiallacciatura tranciata di circa 0,6-0,8 mm di spessore da un produttore affidabile perché queste impiallacciature sono utilizzate per la produzione di compensato e legno lamellare impiallacciato (LVL). Questi sono ottenuti da un fornitore di impiallacciatura, come fogli di spessore da 0,6 a 0,8 mm e tagliati in 305 mm su un lato. Un substrato consistente è un impiallacciatura di acero duro (Acer saccharum) a causa della sua levigatezza superficiale e dello spessore costante, ed è un legno duro poroso diffuso e ad alto modulo. Le facce in acero sono comunemente utilizzate nella costruzione di mobili e di solito sono prive di difetti.</li>
	<li>Condizionare il legno, non impilato, a 21 °C e 50% di umidità relativa (RH) per almeno un giorno prima dell'uso. Evitare faccette eccessivamente ondulate, con una superficie irregolare e che contengano difetti tra cui lo scolorimento. NOTA: Altre specie di legno possono essere utilizzate per comprendere le prestazioni di legame dell'adesivo con queste specie. Tuttavia, i legni duri porosi diffusi e i legni teneri con una graduale transizione precoce-legno tardivo sono raccomandati per la loro uniformità. Fai attenzione perché il legno può essere acido o basico o avere estratti sulla superficie che possono alterare il processo di polimerizzazione dell'adesivo. Inoltre, la lavorazione dell'albero dal momento del taglio alla produzione dell'impiallacciatura può alterare la forza di legame12,13. Poiché l'ABES utilizza una piccola quantità di legno, è meno influenzato dalle variazioni del legno che si verificano con altri test, come il contenuto di umidità del legno e la profondità di controllo dell'impiallacciatura.</li>
	<li>Assicurarsi che i lati dell'impiallacciatura siano privi di fibre sciolte lungo il bordo e che il prodotto incollato non abbia alcuna significativa compressione dell'adesivo in quanto tenderà a sovrastimare la forza di adesione poiché non vi è alcuna modifica post-incollaggio dei campioni.</li>
</ol>2. Preparazione dei campioni
<ol><li>Condizionare i campioni di legno a 21 °C e 50% RH per almeno un giorno. Controllare l'impiallacciatura per eventuali crepe, scolorimento o irregolarità della grana da evitare durante il taglio dei campioni.</li>
	<li>Assicurarsi che il dispositivo di taglio dei campioni azionato pneumaticamente sia operativo.</li>
	<li>Utilizzare una fustellatrice speciale che taglia la dimensione richiesta del campione di 20 mm per 117 mm da 0,6 a 0,8 mm di spessore impiallacciatura d'acero (Figura 1, Tabella dei materiali).<ol><li>Posizionare un pezzo di impiallacciatura, almeno 150 mm per 300 mm, sotto le lame di taglio in modo che la grana dell'impiallacciatura sia parallela alla direzione lunga e premere il pulsante di pressione dell'aria per tagliare ogni pezzo di legno di 20 mm per 117 mm.</li>
		<li>Spostare il pezzo di impiallacciatura sotto le lame di taglio in un'area non tagliata e premere nuovamente il pulsante per tagliare un altro pezzo di legno. Continuare fino a quando il pezzo di impiallacciatura è completamente tagliato a pezzi. NOTA: Se la direzione lunga del provino non è parallela alla direzione del grano, durante una prova può verificarsi una frattura precoce nel legno lontano dalla parte legata.</li>
	</ol></li>
	<li>Per i materiali diversi dal legno, tagliare i campioni utilizzando le tecniche appropriate. Se il materiale non può essere tagliato con il tagliacampioni, utilizzare qualsiasi cosa possa tagliare il materiale per tagliarlo alla dimensione richiesta. A causa della piccola area di incollaggio, è importante che il taglio sia accurato e che i campioni siano privi di detriti lungo i bordi e sulle superfici di incollaggio.</li>
</ol>3. Operabilità dell'apparecchiatura
<ol><li>Per il processo di incollaggio, assicurarsi che l'apparecchiatura ABES funzioni correttamente secondo una procedura operativa standard11. Le impostazioni sulla parte anteriore dell'unità ABES per l'incollaggio e la rottura dei campioni sono: LP Press 0,2 MPa, HP Press 0,2 MPa, Pull 0,65 MPa e Cool Air 0,2 MPa.</li>
	<li>Utilizzare una pressione di alimentazione dell'aria di almeno 0,62 MPa (90 psig) perché una pressione troppo bassa causerà la chiusura troppo lenta o non uniforme dei morsetti e delle piastre di presa sul campione, con conseguente forza di adesione errata (Figura 2, in alto).</li>
	<li>Pulire le piastre di qualsiasi adesivo risultante dalla spremitura dal campione precedente. Regolare la temperatura delle piastre alla temperatura desiderata ed equilibrare prima di incollare i campioni.</li>
	<li>Per incollare il legno, utilizzare l'apparecchiatura in una stanza a 21 ° C e 50% RH. Se ciò non è possibile, conservare i campioni condizionati in un sacchetto di plastica fino all'incollaggio a causa del rapido cambiamento dell'umidità del legno dovuto alle piccole dimensioni dei campioni.</li>
	<li>Per ottenere dati di polimerizzazione cinetica, progettare il metodo in modo tale che le velocità meccaniche ed elettroniche siano sufficienti per raccogliere dati accurati come indicato nella norma ASTM D7998-1911.</li>
</ol>4. Incollaggio dei campioni con l'adesivo
NOTA: L'applicazione dell'adesivo è un problema critico per gli adesivi per legno a causa dell'ampia variazione di viscosità e percentuale di solidi che vanno da un adesivo di laminazione come nel compensato a un adesivo spray per applicazioni leganti. Gli adesivi per legno sono generalmente a base d'acqua, quindi l'evaporazione è solo un problema minore. Tuttavia, l'immersione dell'acqua nel legno poroso è importante.
<ol><li>Stendere 5 mg dell'adesivo in studio sul terminale 0,5 cm sufficientemente per coprire l'area di incollaggio e trasferirlo all'altra campione, ma senza eccessiva compressione. Per ottenere una velocità di diffusione dell'adesivo relativamente costante, tarare il campione di legno su una bilancia e ripesare dopo l'applicazione dell'adesivo.</li>
	<li>Prestare molta attenzione nella distribuzione dell'adesivo, sovrapponendo i campioni e assicurandosi che i due campioni siano allineati, poiché viene utilizzata una piccola area di incollaggio e le forze sono determinate come forza di trazione sull'area incollata (Figura 2 in basso). È possibile utilizzare diverse aree di incollaggio, ma la resistenza non è necessariamente comparabile a causa della variazione della meccanica dei test di taglio del giro. NOTA: La letteratura raccomanda diversi modi per applicare l'adesivo al legno a seconda della consistenza dell'adesivo. Il metodo di applicazione dell'adesivo originariamente raccomandato utilizzava un dispositivo di microspruzzatura appositamente progettato10, ma questo è risultato disordinato, lento e molto dipendente dalla reologia adesiva. Sebbene questo metodo applicasse l'adesivo come punti discreti utilizzati nelle applicazioni di leganti per truciolare e pannelli orientati, un metodo di stampa sembra più affidabile14. Il metodo di applicazione delle micropipette può fornire un volume riproducibile di adesivo10, ma è piuttosto difficile da distribuire uniformemente. Il metodo a spatola ha funzionato al meglio per ottenere una distribuzione uniforme dell'adesivo sull'area di incollaggio e si consiglia una microbilancia per ottenere una quantità misurata11.</li>
	<li>Dati finali sulla resistenza<ol><li>Incollare i campioni a 120 °C per 2 minuti e condizionarli per una notte a 21 °C e 50% di umidità relativa poiché la pressatura a caldo durante l'incollaggio asciuga il legno. Per incollare il legno, bloccare un campione in posizione chiudendo le impugnature sul tester ABES, assicurandosi che il campione sia allineato con il tester. Quindi premere il pulsante di avvio sulla macchina per far premere le piastre da 120 °C sulla sezione sovrapposta per 2 minuti, prima di ritrarre le piastre e allentare le impugnature in modo che i campioni possano essere rimossi. NOTA: Il tempo e la temperatura per l'indurimento sono dettati dall'applicazione e dalla chimica adesiva. La temperatura e il tempo di incollaggio devono essere ottimizzati in modo che la forza raggiunga il plateau più alto utilizzando temperature e tempi di incollaggio diversi per determinare le condizioni per la massima resistenza. Per i leganti in legno, testare la resistenza al taglio a secco è prezioso, ma il test a umido è generalmente più critico per determinare la durata dell'adesivo e richiede un ammollo a temperatura ambiente di 4 ore del campione in acqua.</li>
		<li>Per i test, bloccare un campione in posizione chiudendo le impugnature sul tester ABES assicurandosi che il campione sia allineato con il tester. Quindi, premendo il pulsante di avvio, lo strumento tira su un'estremità attraverso un servoazionamento mentre l'altra estremità del campione tira su una cella di carico collegata alle impugnature. Questa trazione continua fino a quando il legame si rompe. Il computer registra la forza massima che il campione può sopportare, che viene registrata come forza di legame.<ol><li>Utilizzare la stessa procedura per i campioni asciutti e imbevuti d'acqua. Nel misurare la forza di rottura, fare attenzione a garantire che le impugnature tengano saldamente il legno perché se l'adesivo è molto forte, il legno potrebbe scivolare. Se il campione si rompe al di fuori dell'area incollata, scartare il valore poiché si tratta di misurare la resistenza del legno, non l'adesivo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Sviluppo della forza cinetica<ol><li>Determinare il tasso di sviluppo della resistenza di un adesivo per stimare il tempo di pressatura richiesto per prodotti su larga scala. Seguire la stessa procedura del punto 4.3, tranne variare la temperatura e il tempo. Iniziare la prova di resistenza alla temperatura della piastra di 100 °C, utilizzando tempi di incollaggio di 10, 30, 60, 90, 120, 150, 180 e 210 secondi. Successivamente, aumentare la temperatura di 10 °C e ripetere i tempi di incollaggio fino a quando non vi è più alcuna sezione lineare di forza rispetto al tempo ai tempi di legame bassi.</li>
		<li>Dopo l'incollaggio, ritrarre le piastre e utilizzare la funzione di raffreddamento ad aria dell'ABES per raffreddare il campione a temperatura ambiente e quindi misurare la forza del campione. Iniziando da un tempo di pressatura basso e aumentando prima il tempo per i campioni successivi, raccogliere i dati di forza rispetto al tempo fino a quando l'aumento del tempo si traduce in un aumento minimo o nullo della forza. Quindi facendo la stessa sequenza a temperature più elevate si otterrà il grafico risultante di forza rispetto al tempo e la velocità di guarigione come la pendenza (Figura 3). NOTA: I dati dell'adesivo fenolico nella Figura 3a10 mostrano l'effetto della temperatura sullo sviluppo della forza in momenti diversi. La figura 3b mostra il tasso di sviluppo della resistenza isotermica regressa rispetto alla temperatura. Per ottenere lo sviluppo della resistenza isotermica, il campione è stato raffreddato prima del test. Alcuni adesivi, come l'urea formaldeide15, hanno un tempo di adesione e una temperatura ottimali prima che inizi a verificarsi la degradazione. Questo metodo può rilevare questo problema e determinare le condizioni ottimali.</li>
	</ol></li>
	<li>Resistenza al calore<ol><li>Se il prodotto deve soddisfare una certa resistenza alla temperatura, bloccare il campione incollato nell'unità ABES. Dopo che le piastre sono state riscaldate a quella temperatura, ad esempio 220 °C, al di sopra della quale il legno inizia a degradarsi, chiuderle sul campione preincollato per 2 minuti e quindi aprirle per misurare la forza di adesione come al punto 4.3.2 per determinare l'eventuale rammollimento termico dell'adesivo rispetto alla temperatura di incollaggio di 120°C.</li>
		<li>Ripetere questa prova, tranne per il fatto che le piastre vengono chiuse sul campione per 30 minuti e quindi testate per la resistenza per determinare la resistenza se l'adesivo è degradato termicamente. Il rilascio delle piastre e la resistenza alla prova determineranno la resistenza al calore del campione rispetto al valore prima del riscaldamento. Questo tipo di procedura è stato utilizzato per testare gli adesivi per legno16. Poiché l'ABES utilizza un riscaldamento rapido e può misurare la resistenza a caldo senza spostare il campione su un'altra macchina, può essere utilizzato per distinguere tra le due modalità di guasto (ad esempio, addolcimento termico o degradazione). L'addolcimento termico produce una perdita di forza immediatamente dopo il riscaldamento ed è tipicamente recuperabile. La degradazione chimica avviene gradualmente nel tempo ad alta temperatura e non recupera resistenza meccanica al raffreddamento. NOTA: I produttori di adesivi devono distinguere se la perdita di forza è dovuta all'ammorbidimento termico o alla degradazione chimica, perché questi problemi richiedono soluzioni diverse. Esistono molti metodi che possono misurare le transizioni di rammollimento, comprese altre analisi termiche, ma non distinguono tra un cambiamento nelle proprietà meccaniche e nella struttura chimica.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Analisi dell'immagine della superficie di incollaggio fallita
<ol><li>Poiché l'obiettivo principale è determinare la forza adesiva o il tasso di sviluppo della forza coesiva, assicurarsi che il cedimento sia all'interno dell'adesivo e non con l'adesione al substrato (Figura 4) o il cedimento del substrato. Se si verifica un cedimento del substrato, l'adesivo ha una resistenza sufficiente. In alternativa, il guasto coesivo nell'adesivo sfuso indica debolezza dell'adesivo. Tuttavia, decidere tra adesione e rottura dell'interfase adesiva può essere difficile17. Per l'analisi del legno sono stati sviluppati vari metodi18.</li>
</ol>

<ol>
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R., Dunky, M., Rohumaa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+wood+bonds:+going+beyond+what+meets+the+eye.">Understanding wood bonds: going beyond what meets the eye.</a> Reviews of Adhesives and Adhesion. 6 (4), 369-440 (2018).</li><li>Frihart, C. R., Dally, B. N., Wescott, J. M., Birkeland, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Based+Adhesives+and+Reliable+Rapid+Small+Scale+Bond+Strength+Testing.">Bio-Based Adhesives and Reliable Rapid Small Scale Bond Strength Testing.</a> International Symposium on Advanced Biomass Science and Technology for Bio-based Products. , (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le fasi critiche della procedura sono le seguenti: selezione dei substrati, preparazione dei campioni, operabilità dell'apparecchiatura e incollaggio dei campioni.
Il substrato deve essere forte, avere difetti minimi (liscio, piatto, senza crepe e senza scolorimento. Impiallacciatura di facciata di un legno duro poroso diffuso con acero da zucchero (Acer saccharum) preferito. La levigatura crea una superficie meno uniforme e più frammentata7. Dopo aver condiz...

L'incollaggio del legno è il più grande mercato di adesivi singoli e ha portato a un uso efficiente delle risorse forestali. Per molti secoli, il legno massiccio è stato utilizzato per la maggior parte delle applicazioni, ad eccezione della costruzione di mobili, senza criteri di prova tranne la durata del prodotto in uso. Tuttavia, i prodotti in legno incollato sono diventati più comuni, a partire dal compensato e dalle travi in legno lamellare, utilizzando adesivi a base biologica 1,2. Sebbene questi prodotti fossero soddisfacenti all'epoca, la sostituzione di soia, caseina e colle di sangue con adesivi sintetici contenenti formaldeide ha portato a proprietà migliorate. Le prestazioni più elevate di questi nuovi adesivi hanno portato a standard di test definiti con aspettative di prestazioni più elevate di quelle ottenibili con la maggior parte degli adesivi a base biologica. Gli adesivi sintetici hanno anche reso possibile l'incollaggio di particelle tra cui segatura per formare truciolari, fibre per formare pannelli di fibre con densità variabili, trucioli per fornire legname orientato e filo parallelo, impiallacciature per produrre compensato e legname laminato impiallacciato, nonché legname con giunzioni a pettine, legno lamellare, legname lamellare incrociato e travetti a I in legno3. Ognuno di questi prodotti ha i propri criteri di prova4. Pertanto, lo sviluppo di un nuovo adesivo può richiedere molto lavoro di formulazione e test approfonditi per determinare se esiste un potenziale per sviluppare una resistenza sufficiente. Questi lunghi test e la complessità delle proprietà del legno e dell'incollaggio del legno5 hanno limitato lo sviluppo di nuovi adesivi. Inoltre, le proprietà meccaniche degli adesivi per legno possono essere diverse quando vengono polimerizzate tra le superfici di legno rispetto a6. L'indurimento a contatto con il legno consente all'acqua e ai componenti a basso peso molecolare dall'adesivo di fuoriuscire, oltre alle complesse interazioni interfase e chimiche dell'adesivo con il legno 3,7.
Lo sviluppo dell'Automated Bonding Evaluation System (ABES) è stato molto utile per comprendere lo sviluppo della resistenza degli adesivi per legno perché è rapido e facile da usare 8,9,10. Il sistema è un'unità integrale che lega i campioni di taglio del giro e quindi misura la forza sotto tensione necessaria per rompere il legame. La sua utilità ha portato allo sviluppo del metodo ASTM D7998-19 che utilizza questo sistema11. Sebbene questo sistema sia stato originariamente progettato per misurare lo sviluppo della forza adesiva in funzione della temperatura e del tempo, può anche misurare la resistenza al calore degli adesivi polimerizzati, nonché la valutazione di routine della forza di adesione. Sebbene il test ABES sia uno strumento di screening preliminare molto utile, come qualsiasi test, ha i suoi limiti e non sostituisce tutti i test specifici di resistenza e durata del prodotto.
Mentre ci sono molti mezzi per misurare le caratteristiche di polimerizzazione degli adesivi, che vanno dalla reometria gel-time alla calorimetria a scansione differenziale, all'analisi meccanica dinamica e alla spettroscopia di molti tipi, solo il metodo ABES misura lo sviluppo della resistenza meccanica. Ciò richiede uno strumento strettamente controllato per il riscaldamento, il raffreddamento e le prove di trazione in opera11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Supplied by user</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Normal supply house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark II Automated Bonding Evaluation System (ABES-II)</td>
			<td>Adhesive Evaluation Systems Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatically driven sample cutting device</td>
			<td>Adhesive Evaluation Systems Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular spatula</td>
			<td>Normal supply house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood supply &#8211; Hard maple</td>
			<td>Besse Forest Products Group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard test method astm d 7998-19 for the cohesive strength development of wood adhesives

Le proprietà degli adesivi per legno polimerizzato sono difficili da studiare a causa della perdita di acqua e altri componenti nel legno, dell'influenza del legno sulla polimerizzazione adesiva e dell'effetto della penetrazione dell'adesivo sull'interfase del legno; Pertanto, il normale test di una pellicola adesiva pulita non è generalmente utile. La maggior parte dei test di forza del legame adesivo del legno sono lenti, laboriosi, possono essere fortemente influenzati dal legno e non forniscono informazioni sulla cinetica di polimerizzazione. Il metodo di prova ASTM D 7998-19, tuttavia, può essere utilizzato per una rapida valutazione della resistenza dei legami di legno. L'uso di una superficie di legno liscia, uniforme e resistente, come l'impiallacciatura in acero, e una pressione di adesione sufficiente riduce gli effetti di adesione e resistenza del legno sulla forza di adesione. Questo metodo ha tre applicazioni principali. Il primo è quello di fornire dati coerenti sullo sviluppo della forza di legame. Il secondo è misurare la resistenza secca e umida dei campioni di taglio del giro legati. Il terzo è comprendere meglio la resistenza al calore adesivo valutando rapidamente la sensibilità termica e distinguendo tra addolcimento termico e degradazione termica.

La procedura è stata ampiamente utilizzata per lo studio degli adesivi proteici presso il Forest Products Laboratory. È stato riscontrato che una resistenza al legame umido inferiore a 2 MPa era insufficiente per giustificare ulteriori test sull'adesivo per legno, mentre superiore a 3 MPa era un risultato promettente per ulteriori test19. Si è dimostrato utile per dimostrare la sensibilità delle condizioni di lavorazione del legno12,13...

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Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

Presentiamo una procedura, ASTM D7998-19, per una valutazione rapida e più coerente della resistenza sia a secco che a umido dei legami adesivi sul legno. Il metodo può anche essere utilizzato per fornire informazioni sullo sviluppo della forza in funzione della temperatura e del tempo o sulla ritenzione della forza fino a 250 °C.

Metodo di prova standard ASTM D 7998-19 per lo sviluppo della resistenza coesiva degli adesivi per legno

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

standard-test-method-astm-d-7998-19-for-cohesive-strength-development

Research

JoVE Journal

Bioengineering

2.8K Views.  USDA, Forest Service. Presentiamo una procedura, ASTM D7998-19, per una valutazione rapida e più coerente della resistenza sia a secco che a umido dei legami adesivi sul legno. Il metodo può anche essere utilizzato per fornire informazioni sullo sviluppo della forza in funzione della temperatura e del tempo o sulla ritenzione della forza fino a 250 °C.

Video: Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

Aumentare le rese cDNA da singola cellula quantità di mRNA nelle reazioni standard di laboratorio della trascrittasi inversa utilizzando Microstreaming acustico

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Ricerca

Bioingegneria

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

Creazione transitori pori della membrana cellulare utilizzando una stampante a getto d&#39;inchiostro standard

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

The Portable Chemical Sterilizer (PCS), D-FENS, and D-FEND ALL: Novel Chlorine Dioxide Decontamination Technologies for the Military

There is a stated Army need for a field-portable, non-steam sterilizer technology that can be used by Forward Surgical Teams, Dental Companies, Veterinary Service Support Detachments, Combat Support Hospitals, and Area Medical Laboratories to sterilize surgical instruments and to sterilize pathological specimens prior to disposal in operating rooms, emergency treatment areas, and intensive care units. The following ensemble of novel, &#8216;clean and green&#8217; chlorine dioxide technologies are versatile and flexible to adapt to meet a number of critical military needs for decontamination6,15. Specifically, the Portable Chemical Sterilizer (PCS) was invented to meet urgent battlefield needs and close critical capability gaps for energy-independence, lightweight portability, rapid mobility, and rugged durability in high intensity forward deployments3. As a revolutionary technological breakthrough in surgical sterilization technology, the PCS is a Modern Field Autoclave that relies on on-site, point-of-use, at-will generation of chlorine dioxide instead of steam. Two (2) PCS units sterilize 4 surgical trays in 1 hr, which is the equivalent throughput of one large steam autoclave (nicknamed &#8220;Bertha&#8221; in deployments because of its cumbersome size, bulky dimensions, and weight). However, the PCS operates using 100% less electricity (0 vs. 9 kW) and 98% less water (10 vs. 640 oz.), significantly reduces weight by 95% (20 vs. 450 lbs, a 4-man lift) and cube by 96% (2.1 vs. 60.2 ft3), and virtually eliminates the difficult challenges in forward deployments of repairs and maintaining reliable operation, lifting and transporting, and electrical power required for steam autoclaves.

The Portable Chemical Sterilizer PCS, D-FENS, and D-FEND ALL: Novel Chlorine Dioxide Decontamination Technologies for the Military

The Portable Chemical Sterilizer (PCS) is a revolutionary, energy-independent, almost waterless sterilization technology for Army medical units. The PCS generates chlorine dioxide from dry reagents mixed with water on-site, at-will, and at point-of-use (PoU) in a plastic suitcase. The Disinfectant-sprayer for Foods and ENvironmentally-friendly Sanitation (D-FENS) and the Disinfectant for ENvironmentally-friendly Decontamination, All-purpose (D-FEND ALL) produce aqueous chlorine dioxide in a collapsible spray bottle and other potential embodiments. These versatile decontamination technologies kill microbes in myriad diverse Dual-use applications for military and civilian consumers.

Il Portable Chemical Sterilizzatore (PCS), D-FENS, e D-Fend TUTTI: Telenovella biossido di cloro Decontaminazione Tecnologie per il militare

There is a stated Army need for a field-portable, non-steam sterilizer technology that can be used by Forward Surgical Teams, Dental Companies, Veterinary ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

Fabbricazione di Nanotubi di carbonio ad alta frequenza Nanoelectronic biosensore per la rilevazione in alta forza ionica Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Metodi per caratterizzare il co-sviluppo di biofilm e Habitat Eterogeneità

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Solid Lipid nanoparticelle (linfonodi sentinella) Applicazioni per intracellulare targeting

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

Sviluppo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Oculare piattaforma per testare Lenti a contatto

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. Globally, 4.5 billion people are economically dependent on the sea, where most of their livelihood is provided by coral reefs. Corals are of great importance and therefore their extinction leads to catastrophic consequences. There are several possible solutions to remediate marine pollutants and local contamination, including bioremediation. Bioremediation is the capacity of organisms to degrade contaminants. The approach presents several advantages, such as sustainability, relatively low cost, and the fact that it can be applied in different ecosystems, causing minimal impacts to the environment. As an extra advantage, the manipulation of endogenous microbiomes, including putative beneficial microorganisms for corals (pBMCs), may have probiotic effects for marine animals. In this context, the use of the two approaches, bioremediation and pBMC inoculation combined, could be promising. This strategy would promote the degradation of specific pollutants that can be harmful to corals and other metaorganisms while also increasing host resistance and resilience to deal with pollution and other threats. This method focuses on the selection of pBMCs to degrade two contaminants: the synthetic estrogen 17a-ethinylestradiol (EE2) and crude oil. Both have been reported to negatively impact marine animals, including corals, and humans. The protocol describes how to isolate and test bacteria capable of degrading the specific contaminants, followed by a description of how to detect some putative beneficial characteristics of these associated microbes to their coral host. The methodologies described here are relatively cheap, easy to perform, and highly adaptable. Almost any kind of soluble target compound can be used instead of EE2 and oil.

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. Bioremediation is the capacity of organisms to degrade contaminants. Here, we describe methodologies to isolate and test microbes presenting bioremediation ability and potential probiotic characteristics for corals.

Prospezione ceppi microbici per biorimediazione e lo sviluppo di probiotici per la ricerca e la conservazione dei metaorganismi

Pollution affects all biomes. Marine environments have been particularly impacted, especially coral reefs, one of the most sensitive ecosystems on Earth. ...