Este trabalho foi apoiado pela concessão do United Soybean Board 1940-352-0701-C e pelo Departamento de Agricultura dos EUA\Serviço Florestal. Agradecemos o apoio e as informações detalhadas de Phil Humphrey da AES.

1. Preparação de substratos
<ol><li>Use uma superfície de substrato adequada para a aplicação. Para madeira, use um folheado fatiado de cerca de 0,6 a 0,8 mm de espessura de um produtor confiável, pois esses folheados são usados para a fabricação de madeira compensada e laminada (LVL). Estes são obtidos de um fornecedor de folheados, como folhas de 0,6 a 0,8 mm de espessura e cortadas em 305 mm em um lado. Um substrato consistente é um folheado de face de bordo duro (Acer saccharum) por causa de sua suavidade superficial e espessura consistente, e é uma madeira de lei porosa e de alto módulo difusa. As facetas de bordo são comumente usadas na construção de armários e geralmente estão livres de defeitos.</li>
	<li>Condicionar a madeira, não empilhada, a 21 °C e a 50% de humidade relativa (UR) durante, pelo menos, um dia antes da utilização. Evite folheados excessivamente ondulados, com uma superfície irregular e que contenham defeitos, incluindo descoloração. NOTA: Outras espécies de madeira podem ser usadas para entender o desempenho de ligação do adesivo com essas espécies. No entanto, madeiras de lei difusas-porosas e madeiras macias com uma transição gradual de madeira precoce para madeira tardia são recomendadas por sua uniformidade. Tome cuidado porque a madeira pode ser ácida ou básica ou ter extrativos na superfície que podem alterar o processo de cura adesiva. Além disso, o processamento da árvore desde o momento do corte até a produção da faceta pode alterar a resistência de aderência12,13. Como o ABES usa uma pequena quantidade de madeira, ele é menos afetado por variações de madeira que ocorrem com outros testes, como o teor de umidade da madeira e a profundidade de verificação do folheado.</li>
	<li>Certifique-se de que os lados do folheado estejam livres de quaisquer fibras soltas ao longo da borda e o produto colado não tenha nenhum adesivo significativo espremer, pois estes tenderão a superestimar a resistência de aderência, uma vez que não há modificação pós-colagem das amostras.</li>
</ol>2. Preparação de espécimes
<ol><li>Condicionar os provetes de madeira a 21 °C e a 50% UR durante, pelo menos, um dia. Verifique se há rachaduras, descoloração ou irregularidades de grãos a serem evitadas ao cortar os espécimes.</li>
	<li>Certifique-se de que o dispositivo de corte de amostra acionado pneumaticamente está operacional.</li>
	<li>Use um cortador de matrizes especial que corte o tamanho de amostra necessário de 20 mm por 117 mm de 0,6 a 0,8 mm de espessura de folheado de bordo (Figura 1, Tabela de Materiais).<ol><li>Coloque um pedaço de folheado, pelo menos 150 mm por 300 mm, sob as lâminas de corte de modo que o grão do folheado fique paralelo com a direção longa e pressione o botão de pressão do ar para cortar cada pedaço de madeira de 20 mm por 117 mm.</li>
		<li>Mova o pedaço de folheado sob as lâminas de corte para uma área não cortada e pressione o botão novamente para cortar outro pedaço de madeira. Continue até que o pedaço de folheado esteja completamente cortado em pedaços. NOTA: Se a direção longa da amostra não for paralela à direção do grão, durante um teste pode ocorrer fratura precoce na madeira longe da porção ligada.</li>
	</ol></li>
	<li>Para outros materiais que não a madeira, cortar os espécimes utilizando as técnicas adequadas. Se o material não puder ser cortado com o cortador de amostras, use o que cortar o material para cortá-lo no tamanho necessário. Devido à pequena área de colagem, é importante que o corte seja preciso e os espécimes livres de detritos ao longo das bordas e nas superfícies de colagem.</li>
</ol>3. Operacionalidade do equipamento
<ol><li>Para o processo de colagem, certifique-se de que o equipamento ABES está funcionando corretamente de acordo com um procedimento operacional padrão11. As configurações na parte frontal da unidade ABES para amostras de colagem e quebra são: LP Press 0.2 MPa, HP Press 0.2 MPa, Pull 0.65 MPa e Cool Air 0.2 MPa.</li>
	<li>Use a pressão de fornecimento de ar de pelo menos 0,62 MPa (90 psig) porque a pressão muito baixa fará com que as braçadeiras e placas de preensão se fechem muito lenta ou desigualmente na amostra, resultando em forças de aderência incorretas (Figura 2, acima).</li>
	<li>Limpe as placas de qualquer adesivo resultante da compressão da amostra anterior. Ajustar a temperatura das placas à temperatura desejada e equilibrar-se antes de colagem das amostras.</li>
	<li>Para unir a madeira, opere o equipamento em uma sala que esteja a 21 °C e 50% UR. Se isso não for possível, mantenha os espécimes condicionados em um saco plástico até a colagem devido à rápida mudança na umidade da madeira devido ao pequeno tamanho dos espécimes.</li>
	<li>Para a obtenção de dados de cura cinética, projete o método de modo que as velocidades mecânica e eletrônica sejam suficientes para coletar dados com precisão, conforme descrito na norma ASTM D7998-1911.</li>
</ol>4. Colagem dos espécimes com o adesivo
NOTA: A aplicação do adesivo é uma questão crítica para adesivos de madeira devido à grande variação na viscosidade e porcentagem de sólidos que vão de um adesivo de laminação como em madeira compensada para um adesivo spray capaz de aglutinante. Os adesivos de madeira são geralmente à base de água, de modo que a evaporação é apenas um problema menor. No entanto, a imersão de água na madeira porosa é importante.
<ol><li>Espalhar 5 mg do adesivo a estudar sobre o terminal 0,5 cm o suficiente para cobrir a área de colagem e transferir para o outro provete, mas sem espremer excessivamente. Para obter uma taxa de propagação adesiva relativamente constante, reboque o espécime de madeira em uma balança e repese após a aplicação do adesivo.</li>
	<li>Tenha muito cuidado na distribuição do adesivo, sobrepondo os corpos de prova e certificando-se de que os dois corpos estejam alinhados, uma vez que uma pequena área de colagem é utilizada e as forças são determinadas como a força de tração sobre a área colada (Figura 2 abaixo). Diferentes áreas de colagem podem ser usadas, mas a resistência não é necessariamente comparável devido à variação na mecânica dos testes de cisalhamento de volta. NOTA: A literatura recomenda várias maneiras de aplicar o adesivo na madeira, dependendo da consistência do adesivo. O método de aplicação de adesivo originalmente recomendado usava um dispositivo de micropulverização projetado para fins específicos10, mas isso foi considerado confuso, lento e muito dependente da reologia adesiva. Embora esse método tenha aplicado o adesivo como pontos discretos como utilizado em aplicações de aglutinantes para aglomerado e aparador orientado, um método de impressão parece mais confiável14. O método de aplicação de micropipetas pode fornecer um volume reprodutível de adesivo10, mas é um pouco difícil de distribuir uniformemente. O método da espátula tem funcionado melhor para a obtenção de uma distribuição uniforme do adesivo na área de colagem, sendo recomendada uma microbalança para a obtenção de uma quantidade medida11.</li>
	<li>Dados de resistência final<ol><li>Unir os corpos de prova a 120 °C durante 2 min e condicioná-los durante a noite a 21 °C e 50% UR, uma vez que a prensagem a quente durante a colagem seca a madeira. Para unir a madeira, prenda uma amostra no lugar fechando as alças no testador ABES, certificando-se de que a amostra está alinhada com o testador. Em seguida, pressione o botão de partida na máquina para que as placas de 120 °C pressionem a seção sobreposta por 2 minutos, antes de retrair as placas e soltar as alças para que as amostras possam ser removidas. NOTA: O tempo e a temperatura para a cura são ditados pela aplicação e pela química do adesivo. A temperatura e o tempo de ligação devem ser otimizados para que a resistência atinja o platô mais alto usando diferentes temperaturas e tempos de ligação para determinar as condições de resistência máxima. Para ligações de madeira, o teste de resistência ao cisalhamento seco é valioso, mas o teste úmido geralmente é mais crítico para determinar a durabilidade do adesivo e requer uma imersão de 4 horas à temperatura ambiente da amostra em água.</li>
		<li>Para o teste, bloqueie uma amostra no lugar fechando as alças no testador ABES, certificando-se de que a amostra esteja alinhada com o testador. Em seguida, pressionando o botão de início, o instrumento puxa uma extremidade através de um servodrive, enquanto a outra extremidade da amostra puxa uma célula de carga presa às alças. Esse puxão continua até que o vínculo se rompa. O computador registra a força máxima que a amostra pode suportar, que é registrada como força de ligação.<ol><li>Use o mesmo procedimento para as amostras secas e embebidas em água. Ao medir a força de ruptura, tome cuidado para garantir que os punhos segurem a madeira com força, porque se o adesivo for muito forte, a madeira pode escorregar. Se a amostra quebrar fora da área colada, descarte o valor, pois isso está medindo a resistência da madeira, não o adesivo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Desenvolvimento da força cinética<ol><li>Determine a taxa de desenvolvimento de resistência de um adesivo para estimar o tempo de impressão necessário para produtos de grande escala. Siga o mesmo procedimento que na etapa 4.3, exceto variar a temperatura e o tempo. Comece o teste de resistência à temperatura da placa de 100 °C, usando tempos de colagem de 10, 30, 60, 90, 120, 150, 180 e 210 segundos. Posteriormente, aumente a temperatura em 10 °C e repita os tempos de colagem até que não haja mais nenhuma seção linear de força versus tempo nos baixos tempos de ligação.</li>
		<li>Após a colagem, retraia as placas e use o recurso de resfriamento de ar do ABES para resfriar a amostra até perto da temperatura ambiente e, em seguida, medir a resistência da amostra. Começando em um tempo de prensagem baixo e aumentando primeiro o tempo para amostras subsequentes, colete os dados de força versus tempo até que o aumento do tempo resulte em pouca ou nenhuma força crescente. Em seguida, fazer a mesma sequência em temperaturas mais altas produzirá o gráfico resultante de força versus tempo e a taxa de cura como a inclinação (Figura 3). NOTA: Os dados do adesivo fenólico na Figura 3a10 mostram o efeito da temperatura no desenvolvimento da resistência em diferentes momentos. A Figura 3b mostra a taxa de desenvolvimento da resistência isotérmica regredida versus temperatura. Para a obtenção do desenvolvimento da resistência isotérmica, a amostra foi resfriada antes do teste. Alguns adesivos, como o ureia-formaldeído15, têm um tempo e temperatura de colagem ideais antes que a degradação comece a ocorrer. Esse método pode detectar esse problema e determinar as condições ideais.</li>
	</ol></li>
	<li>Resistência ao calor<ol><li>Se o produto precisar atender a uma certa resistência à temperatura, prenda a amostra colada na unidade ABES. Depois de as placas serem aquecidas a essa temperatura, por exemplo, a 220 °C, acima da qual a madeira começa a degradar-se, feche na amostra pré-colada durante 2 min e, em seguida, abra para medir a resistência de aderência como no ponto 4.3.2 para determinar qualquer amolecimento térmico do adesivo em comparação com a temperatura de colagem de 120 °C.</li>
		<li>Repetir este ensaio, excepto se as placas forem fechadas na amostra durante 30 minutos e, em seguida, ensaiadas quanto à resistência para determinar a resistência se o adesivo estiver termicamente degradado. A liberação das placas e a resistência do teste determinarão a resistência ao calor da amostra em comparação com o valor antes do aquecimento. Esse tipo de procedimento foi utilizado para testar adesivos de madeira16. Como o ABES usa aquecimento rápido e pode medir a força enquanto quente sem mover a amostra para outra máquina, ele pode ser usado para diferenciar entre os dois modos de falha (ou seja, amolecimento térmico ou degradação). O amolecimento térmico produz perda de força imediatamente após o aquecimento e é tipicamente recuperável. A degradação química ocorre gradualmente ao longo do tempo em alta temperatura e não recupera a resistência mecânica no resfriamento. NOTA: Os fabricantes de adesivos precisam diferenciar se a perda de resistência é de amolecimento térmico ou degradação química, porque esses problemas exigem soluções diferentes. Existem muitos métodos que podem medir transições de amolecimento, incluindo outras análises térmicas, mas eles não distinguem entre uma mudança nas propriedades mecânicas e na estrutura química.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Análise de imagem da superfície de colagem com falha
<ol><li>Como o objetivo principal é determinar a resistência adesiva ou a taxa de desenvolvimento da resistência coesiva, certifique-se de que a falha esteja dentro do adesivo e não com adesão ao substrato (Figura 4) ou falha do substrato. Se ocorrer falha do substrato, o adesivo tem resistência suficiente. Alternativamente, a falha coesiva no adesivo a granel indica fraqueza do adesivo. No entanto, decidir entre adesão e falha interfásica adesiva pode ser difícil17. Uma variedade de métodos tem sido desenvolvida para a análise da madeira18.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lambuth, A., Pizzi, A., Mittal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+adhesives+for+wood.">Protein adhesives for wood.</a> Handbook of Adhesive Technology. , 457-477 (2003).</li><li>Keimel, F. A., Pizzi, A., Mittal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+development+of+adhesives+and+adhesive+bonding.">Historical development of adhesives and adhesive bonding.</a> Handbook of Adhesive Technology. , 1-12 (2003).</li><li>Marra, A. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+some+process+variables+on+the+lap-shear+strength+of+aspen+strands+uniformly+coated+with+pmdi-resin.">The effect of some process variables on the lap-shear strength of aspen strands uniformly coated with pmdi-resin.</a> Wood and Fiber Science. 36 (2), 228-238 (2004).</li><li>Pizzi, A., Pizzi, A., Mittal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urea-formaldehyde+adhesives.">Urea-formaldehyde adhesives.</a> Handbook of Adhesive Technology. , 635-652 (2003).</li><li>O'Dell, J. L., Hunt, C. G., Frihart, C. 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R., Dunky, M., Rohumaa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+wood+bonds:+going+beyond+what+meets+the+eye.">Understanding wood bonds: going beyond what meets the eye.</a> Reviews of Adhesives and Adhesion. 6 (4), 369-440 (2018).</li><li>Frihart, C. R., Dally, B. N., Wescott, J. M., Birkeland, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-Based+Adhesives+and+Reliable+Rapid+Small+Scale+Bond+Strength+Testing.">Bio-Based Adhesives and Reliable Rapid Small Scale Bond Strength Testing.</a> International Symposium on Advanced Biomass Science and Technology for Bio-based Products. , (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As etapas críticas no procedimento são as seguintes: seleção de substratos, preparação de espécimes, operacionalidade do equipamento e colagem de amostras.
O substrato deve ser forte, ter defeitos mínimos (liso, plano, sem rachaduras e sem descoloração. Folheado de face de armário de corte rotativo não lixado de uma madeira porosa difusa com bordo de açúcar (Acer saccharum) preferido. O lixamento cria uma superfície menos uniforme e mais fragmentada7</...

A colagem de madeira é o maior mercado único de adesivos e levou ao uso eficiente dos recursos florestais. Por muitos séculos, a madeira maciça foi usada para a maioria das aplicações, exceto para a construção de móveis, sem critérios de teste, exceto a durabilidade do produto em uso. No entanto, os produtos de madeira colada tornaram-se mais comuns, a começar pelas vigas de compensado e glulam, utilizando adesivos de base biológica 1,2. Embora esses produtos fossem satisfatórios na época, a substituição de colas, de soja, caseína e sangue por adesivos sintéticos contendo formaldeído levou a propriedades melhoradas. O maior desempenho desses novos adesivos levou a padrões de teste definidos com expectativas de desempenho mais altas do que o alcançável com a maioria dos adesivos de base biológica. Os adesivos sintéticos também possibilitaram a colagem de partículas, incluindo serragem para formar aglomerados, fibras para formar painéis de fibras com densidades variadas, cavacos para fornecer aparador orientado e madeira de fio paralelo, folheados para produzir madeira compensada e laminada laminada, bem como madeira unida por dedo, glulam, madeira laminada cruzada e I-joists de madeira3. Cada um desses produtos tem seus próprios critérios de teste4. Assim, o desenvolvimento de um novo adesivo pode exigir muito trabalho de formulação e testes extensivos para determinar se há algum potencial para desenvolver resistência suficiente. Este teste demorado e a complexidade das propriedades da madeira e da colagem da madeira5 limitaram o desenvolvimento de novos adesivos. Além disso, as propriedades mecânicas dos adesivos de madeira podem ser diferentes quando curadas entre superfícies de madeira, em oposição a6 puras. A cura em contato com a madeira permite a fuga de água e componentes de baixo peso molecular do adesivo, além de complexas interações interfásicas e químicas do adesivo com a madeira 3,7.
O desenvolvimento do Sistema Automatizado de Avaliação de Colagem (ABES) tem sido muito útil para a compreensão do desenvolvimento da resistência dos adesivos de madeira, pois é rápido e fácil de usar 8,9,10. O sistema é uma unidade integral que liga amostras de cisalhamento de volta e, em seguida, mede a força sob tensão necessária para quebrar a ligação. Sua utilidade levou ao desenvolvimento do método ASTM D7998-19 que usa este sistema11. Embora este sistema tenha sido originalmente projetado para medir o desenvolvimento da resistência adesiva em função da temperatura e do tempo, ele também pode medir a resistência ao calor dos adesivos curados, bem como a avaliação rotineira da resistência à aderência. Embora o teste ABES seja uma ferramenta de triagem preliminar muito útil, como qualquer teste, ele tem suas limitações e não substitui todos os testes específicos de resistência e durabilidade do produto.
Embora existam muitos meios de medir as características de cura dos adesivos, variando de reometria em tempo de gel a calorimetria diferencial de varredura, análise mecânica dinâmica e espectroscopia de muitos tipos, apenas o método ABES mede o desenvolvimento da resistência mecânica. Isso requer um instrumento que seja rigidamente controlado para aquecimento, resfriamento e testes de tração no local11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive</td>
			<td>Supplied by user</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Normal supply house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mark II Automated Bonding Evaluation System (ABES-II)</td>
			<td>Adhesive Evaluation Systems Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatically driven sample cutting device</td>
			<td>Adhesive Evaluation Systems Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regular spatula</td>
			<td>Normal supply house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wood supply &#8211; Hard maple</td>
			<td>Besse Forest Products Group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

standard test method astm d 7998-19 for the cohesive strength development of wood adhesives

As propriedades dos adesivos de madeira curada são difíceis de estudar devido à perda de água e outros componentes para a madeira, à influência da madeira na cura adesiva e ao efeito da penetração do adesivo na interfase da madeira; assim, o teste normal de um filme adesivo limpo geralmente não é útil. A maioria dos testes de resistência de aderência adesiva de madeira é lenta, trabalhosa, pode ser fortemente influenciada pela madeira e não fornece informações sobre a cinética da cura. O método de teste ASTM D 7998-19, no entanto, pode ser usado para avaliação rápida da resistência de ligações de madeira. O uso de uma superfície de madeira lisa, uniforme e forte, como o folheado de face de bordo, e pressão de colagem suficiente reduzem os efeitos de aderência e resistência da madeira na resistência de ligação. Este método tem três aplicações principais. A primeira é fornecer dados consistentes sobre o desenvolvimento da força de ligação. A segunda é medir as resistências a seco e molhado de amostras de cisalhamento de colo ligadas. A terceira é entender melhor a resistência ao calor do adesivo, avaliando rapidamente a sensibilidade térmica e distinguindo entre amolecimento térmico e degradação térmica.

O procedimento tem sido amplamente utilizado para o estudo de adesivos proteicos no Laboratório de Produtos Florestais. Verificou-se que menos de 2 MPa de resistência de aderência úmida era insuficiente para justificar mais testes de adesivo de madeira, enquanto maior que 3 MPa era um resultado promissor para testes adicionais19. Tem se mostrado útil para demonstrar sensibilidade das condições de processamento de madeira12,13. Outro...

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Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

Apresentamos um procedimento, ASTM D7998-19, para uma avaliação rápida e mais consistente da resistência seca e úmida das ligações adesivas em madeira. O método também pode ser usado para fornecer informações sobre o desenvolvimento da resistência em função da temperatura e do tempo ou da retenção de força até 250 °C.

Método de Teste Padrão ASTM D 7998-19 para o Desenvolvimento de Resistência Coesiva de Adesivos de Madeira

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

standard-test-method-astm-d-7998-19-for-cohesive-strength-development

Research

JoVE Journal

Bioengineering

2.8K visualizações.  USDA, Forest Service. Apresentamos um procedimento, ASTM D7998-19, para uma avaliação rápida e mais consistente da resistência seca e úmida das ligações adesivas em madeira. O método também pode ser usado para fornecer informações sobre o desenvolvimento da resistência em função da temperatura e do tempo ou da retenção de força até 250 °C.

Vídeo: Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Bioengenharia

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Medição de Coesão agregados por tensiometria superfície do tecido

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level. However, this is not easily achieved because the small amount of labile mRNA present in a single cell (1-5% of 1-50pg total RNA, or 0.01-2.5pg mRNA, per cell 1) mostly degrades before it can be reverse transcribed into a stable cDNA copy. For example, using standard laboratory reagents and hardware, only a small number of genes can be qualitatively assessed per cell 2. One way to increase the efficiency of standard laboratory reverse transcriptase (RT) reactions (i.e. standard reagents in microliter volumes) comprising single-cell amounts of mRNA would be to more rapidly mix the reagents so the mRNA can be converted to cDNA before it degrades. However this is not trivial because at microliter scales liquid flow is laminar, i.e. currently available methods of mixing (i.e. shaking, vortexing and trituration) fail to produce sufficient chaotic motion to effectively mix reagents. To solve this problem, micro-scale mixing techniques have to be used 3,4. A number of microfluidic-based mixing technologies have been developed which successfully increase RT reaction yields 5-8. However, microfluidics technologies require specialized hardware that is relatively expensive and not yet widely available. A cheaper, more convenient solution is desirable. The main objective of this study is to demonstrate how application of a novel "micromixing" technique to standard laboratory RT reactions comprising single-cell quantities of mRNA significantly increases their cDNA yields. We find cDNA yields increase by approximately 10-100-fold, which enables: (1) greater numbers of genes to be analyzed per cell; (2) more quantitative analysis of gene expression; and (3) better detection of low-abundance genes in single cells. The micromixing is based on acoustic microstreaming 9-12, a phenomenon where sound waves propagating around a small obstacle create a mean flow near the obstacle. We have developed an acoustic microstreaming-based device ("micromixer") with a key simplification; acoustic microstreaming can be achieved at audio frequencies by ensuring the system has a liquid-air interface with a small radius of curvature 13. The meniscus of a microliter volume of solution in a tube provides an appropriately small radius of curvature. The use of audio frequencies means that the hardware can be inexpensive and versatile 13, and nucleic acids and other biochemical reagents are not damaged like they can be with standard laboratory sonicators.

We describe a novel method for increasing cDNA yield from single-cell quantities of mRNA in otherwise standard laboratory reverse transcription reactions. The novelty resides in the use of a micromixer, which utilizes the phenomenon of acoustic microstreaming, to mix fluids at microliter scales more effectively than shaking, vortexing or trituration.

Aumentar os rendimentos cDNA Single-cell quantidades de mRNA em Laboratório Padrão Reações transcriptase reversa usando Microstreaming Acústico

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

Criando poros celulares transitórios membrana utilizando uma impressora jato de tinta padrão

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

The Portable Chemical Sterilizer (PCS), D-FENS, and D-FEND ALL: Novel Chlorine Dioxide Decontamination Technologies for the Military

There is a stated Army need for a field-portable, non-steam sterilizer technology that can be used by Forward Surgical Teams, Dental Companies, Veterinary Service Support Detachments, Combat Support Hospitals, and Area Medical Laboratories to sterilize surgical instruments and to sterilize pathological specimens prior to disposal in operating rooms, emergency treatment areas, and intensive care units. The following ensemble of novel, &#8216;clean and green&#8217; chlorine dioxide technologies are versatile and flexible to adapt to meet a number of critical military needs for decontamination6,15. Specifically, the Portable Chemical Sterilizer (PCS) was invented to meet urgent battlefield needs and close critical capability gaps for energy-independence, lightweight portability, rapid mobility, and rugged durability in high intensity forward deployments3. As a revolutionary technological breakthrough in surgical sterilization technology, the PCS is a Modern Field Autoclave that relies on on-site, point-of-use, at-will generation of chlorine dioxide instead of steam. Two (2) PCS units sterilize 4 surgical trays in 1 hr, which is the equivalent throughput of one large steam autoclave (nicknamed &#8220;Bertha&#8221; in deployments because of its cumbersome size, bulky dimensions, and weight). However, the PCS operates using 100% less electricity (0 vs. 9 kW) and 98% less water (10 vs. 640 oz.), significantly reduces weight by 95% (20 vs. 450 lbs, a 4-man lift) and cube by 96% (2.1 vs. 60.2 ft3), and virtually eliminates the difficult challenges in forward deployments of repairs and maintaining reliable operation, lifting and transporting, and electrical power required for steam autoclaves.

The Portable Chemical Sterilizer PCS, D-FENS, and D-FEND ALL: Novel Chlorine Dioxide Decontamination Technologies for the Military

The Portable Chemical Sterilizer (PCS) is a revolutionary, energy-independent, almost waterless sterilization technology for Army medical units. The PCS generates chlorine dioxide from dry reagents mixed with water on-site, at-will, and at point-of-use (PoU) in a plastic suitcase. The Disinfectant-sprayer for Foods and ENvironmentally-friendly Sanitation (D-FENS) and the Disinfectant for ENvironmentally-friendly Decontamination, All-purpose (D-FEND ALL) produce aqueous chlorine dioxide in a collapsible spray bottle and other potential embodiments. These versatile decontamination technologies kill microbes in myriad diverse Dual-use applications for military and civilian consumers.

O Portable Chemical Esterilizador (PCS), D-Fens, e D-Fend TODOS: Novela de dióxido de cloro descontaminação Tecnologias para o Militar

There is a stated Army need for a field-portable, non-steam sterilizer technology that can be used by Forward Surgical Teams, Dental Companies, Veterinary ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

Fabricação de Nanotubos de Carbono de Alta Frequência Nanoelectronic Biosensor de Sensoriamento em High Solutions força iônica

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

Métodos de caracterização da Co-desenvolvimento de biofilme e Habitat Heterogeneidade

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.