Questo protocollo consente il tracciamento e la quantificazione della degradazione di una proteina di interesse per i C.elegans vivi e invecchiati. Questa tecnica in vivo e non invasiva richiede solo poca microscopia impostata per convertire in modo affidabile Dendra2 in un fluoroforo luminoso e stabile. Il metodo è adattabile ai sistemi dei mammiferi, così come al pesce zebra.
Studiare, inserire il fatturato all'interno della rete proteostatis, nonché i trasporti e il traffico. Fare attenzione a non provocare conversioni indesiderate di Dendra2 durante la scansione con il laser a luce blu e a testare e ottimizzare le impostazioni di acquisizione e conversione per ogni sistema e proteina di fusione. Inizia coltivando nematodi abbinati all'età a 20 gradi Celsius all'età desiderata per l'esperimento.
Il giorno dell'esperimento di imaging, sciogliere l'agarosio di grado generale a una concentrazione del 3% in acqua distillata doppia. Mentre l'agarosio si sta raffreddando, tagliare la punta di una punta di pipetta millilitro per facilitare l'aspirazione di circa 400 microlitri dell'agarosio fuso. Aggiungere con cura alcune gocce di agarosio su uno scivolo di vetro pulito e posizionare immediatamente un altro scivolo sopra le gocce per creare un sottile tampone di agarosio tra i due pezzi di vetro.
Quando l'agarosio si è asciugato, rimuovere con cura lo scivolo superiore. Quando sono state preparate abbastanza diapositive, aprire il software al microscopio confocale e impostare il percorso della luce per l'eccitazione e l'emissione. Per dendra2 verde aggiungere da 486 a 553 nanometri, e per dendra2 rosso aggiungere da 580 a 740 nanometri.
Regolare la potenza e il guadagno di entrambi i canali in base all'intensità del fluoroforo e impostare il foro a spillo in modo che si apra completamente. Selezionare una modalità canale sequenziale e impostare la traccia per cambiare ogni fotogramma. Impostare la modalità di scansione come fotogramma e le dimensioni del fotogramma come 1024 entro 1024 con un passo di linea di uno.
Impostare la media su due e sulla media in base al metodo medio e alla modalità della linea unidirezionale. Impostare la profondità del bit su otto bit. Definite l'impostazione di acquisizione multidimensionale per la conversione di Dendra2.
Per la conversione e lo sbiancamento, utilizzare il laser a diodo da 405 nanometri impostato sul 60% di energia. Selezionare una serie temporale di due cicli con un intervallo di 0,0 millisecondi tra i cicli e un normale inizio e arresto. Impostare lo sbiancamento per iniziare dopo la scansione uno dei due, ripetere per 30 iterazioni e fermarsi quando l'intensità scende al 50%Quindi, definire la velocità del pixel di acquisizione in modo che si rilevi rapidamente per la conversione e su medio per acquisire un'immagine di aggancio.
Per montare i nematodi sulle diapositive, utilizzare un marcatore permanente per disegnare e numerare una finestra con quattro quadrati sull'opposto del pad di agarosio su ogni diapositiva. Aggiungere 15 microlitri di levamisolo al centro del pad di agarosio e utilizzare un microscopio stereo e un piccone di filo da trasferire per nematodi abbinati all'età nella goccia. Utilizzare un piccone per spostare delicatamente ogni nematode in una finestra del quadrato.
Quando tutti i nematodi sono stati riposizionati, attendere che i vermi abbiano smesso di muoversi prima di posizionare una copertura scivolare sul liquido per immobilizzare i nematodi durante l'imaging. Quindi, posizionare lo scivolo sullo stadio del microscopio confocale. Per la conversione dendra2 verde, utilizzare l'oculare dell'obiettivo 20 X sotto la fluorescenza verde per localizzare il primo nematode e concentrarsi sulla testa o sulla coda.
Passare alla modalità confocale e aumentare o diminuire il guadagno e la potenza laser per ottenere un'immagine satura, ma non sovraesposta. Disegna una regione di interesse attorno al neurone selezionato e disegna una seconda regione di interesse più grande intorno alla coda che include la prima regione di interesse. Impostare la prima regione da acquisire, sbiancare e analizzare.
Impostare la seconda regione di interesse da acquisire e analizzare, ma non sbiancata. Impostare la velocità di scansione al massimo e avviare la scansione per convertire i neuroni Dendra2 selezionati. Subito dopo la conversione, inizia la scansione dal vivo con il laser verde da 561 nanometri per visualizzare Dendra2 nel canale rosso e trovare la messa a fuoco e la rispettiva proiezione massima del neurone convertito.
Impostare rapidamente la velocità di scansione su una velocità di rigonfiamento dei pixel inferiore e acquisire un'immagine istantanea di entrambi i canali a una risoluzione più elevata. Questa immagine viene considerata al momento zero dopo la conversione. Quindi, salvare la scansione con un nome e un numero identificabili, seguiti dall'etichetta time zero.
Per tracciare la degradazione di Dendra2 nel tempo, aprire l'immagine per zero del rispettivo neurone nematode. Usando la stessa impostazione dell'immagine, inizia la scansione dal vivo nel canale rosso e porta a fuoco il neurone rosso convertito. Quindi, senza modificare alcun parametri di acquisizione, ottenere un'istantanea alla stessa velocità della prima immagine.
Assicurati di definire attentamente l'impostazione di conversione per convertire Dendra2 in modo efficiente e sufficiente e per mantenere gli stessi parametri di acquisizione in diversi punti di tempo. Per analizzare le immagini Dendra2 convertite, aprite le immagini del tempo zero e del secondo punto di tempo nelle Figi e aprite Analizza e imposta misure. Selezionare le funzioni Area e Densità integrata e selezionare l'immagine ottenuta con il canale rosso.
Utilizzando lo strumento di selezione poligonale, disegna una regione di interesse intorno al tempo in cui zero neurone convertito. Per identificare correttamente i contorni del neurone, selezionate Immagine, Regola e Soglia per evidenziare le soglie di intensità. Una volta definita la selezione, fare clic su Analizza e misura.
Verrà visualizzata una finestra dei risultati popup, che include l'area, la densità integrata e i valori di densità integrata non elaborati per l'area di interesse selezionata. Eseguire lo stesso processo di selezione e misurazione per l'immagine dal secondo punto di tempo. Quindi, copiare i valori nel foglio di calcolo.
In questa analisi rappresentativa prima della conversione, nessun segnale rosso era visibile quando il campione era eccitato nel canale rosso. Dopo l'irradiazione, il segnale verde è diminuito con la conversione dell'HTT-D2 e successivamente è apparso un segnale rosso. L'espressione di HTT-D2 si è degradata nel tempo, con conseguente riduzione dei livelli di segnale HTT-D2 rosso e un possibile aumento del segnale verde HTT-D2 man mano che una maggiore proteina di fusione è stata recentemente sintetizzata.
In particolare, i neuroni della regione della coda sono stati determinati per essere significativamente più attivi rispetto a quelli della testa. Inoltre, c'è stata significativamente più degradazione del controllo HTTQ25-D2 24 ore dopo la conversione, quindi dopo due ore sia nei neuroni testa che coda. Questa differenza non è stata osservata nel HTTQ97-D2 patogeno, tuttavia, suggerendo che la rete di proteostasi non fosse in grado di rimuovere htt-D2 contenente allungamenti di glutammina più lunghi in tutto il sistema nervoso.
HTTQ97-D2 non è stato degradato in modo efficiente come HTTQ25-D2 in nematodi molto vecchi, evidenziando l'incapacità della rete di proteostasi di rimuovere specie aggregate e possibilmente tossiche di Huntingtin negli animali più anziani. È importante sottolineare che i neuroni della coda sono stati in grado di far fronte a HTTQ97-D2 tossici nei giovani nematodi, suggerendo che vari meccanismi di rete di proteostasi concomitanti potrebbero essere al lavoro per rimuovere HTT-D2. Per ogni campione acquisire e non sovraesposta e non saturare l'immagine immediatamente dopo la conversione e riutilizzare la stessa impostazione per quel campione nel tempo.
Con questo protocollo, è possibile testare i cambiamenti in una rete di proteostati e anche, con l'aiuto della microscopia a super risoluzione, tracciare la diffusione delle proteine associate alla malattia.
