Il finanziamento è stato fornito da NSF CCLI # 0633618 e Ohio University. Alcuni ceppi sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center. Studente laureato Reetobrata Basu appare nel video.

NOTA: Più passaggi di protocollo vengono presentati con opzioni per set-up e la preparazione a seconda delle specifiche condizioni dell&#39;esperimento. Per questi casi, passaggi alternativi vengono presentati come A, B, C, ecc Il protocollo con la procedura alternativa è illustrato in Figura 1. 1. Preparazione di diapositive Polilisina rivestite Tre diversi tipi di diapositive possono essere utilizzati a seconda del compromesso desiderato tra facilità di preparazione, relativa adesione, e il legame non specifico dell&#39;anticorpo. Dettagli di alternative preparazione dei vetrini sono riportati alla procedura 1A-1C in ordine crescente di adesione e complessità. Preparato da questi diversi metodi possono essere utilizzati insieme per un singolo esperimento. 1A. Nessuna preparazione del vetrino Disponibili in commercio polilisina rivestita diapositive forniscono bassa adesione e basso fondo. 1B. Presentazione preparation ottimale per la fissazione metanolo, acetone Adesione media e bassa priorità bassa. <ol><li> Preparare una soluzione di polilisina per immergendo i vetrini: Aggiungere 400 mg di peso molecolare molto elevato (150.000 - 300.000 D) poli-L-lisina per 200 ml di acqua distillata. Aggiungere 2 ml di 10% di sodio azide magazzino (concentrazione finale 0,1%) come conservante. ATTENZIONE: secco sodio azide è reattivo e tutte le forme sono tossici. Indossare una maschera e guanti, mentre la polvere di peso per rendere il 10% stock in acqua bidistillata. </li><li> Pulire singolo end lastre di vetro smerigliato con salviette privo di lanugine, macchie rimozione e particelle. Questo dovrebbe essere fatto anche su vetrini acquistati con la denominazione &quot;predepurata&quot;. </li><li> Collocare i vetrini back-to-back in un supporto di diapositive, vaschetta Coplin o altro contenitore di diapositive colorazione, mantenendo i bordi satinati e non del tutto perfettamente allineate (per rendere più facile la separazione in seguito). Mettere titolare fetta in coppa con il 70% di etanolo (alcool grado reagente non necessario) con 1% di HCl in diacqua calmato o compilare vaschetta di colorazione a livello di glassa. Roccia vetrini in soluzione per un minimo di 5 min. ATTENZIONE: Questa soluzione è corrosiva, indossare guanti. NOTA: Questa soluzione può essere riutilizzato più volte (fino a diversi mesi). </li><li> Sciacquare i vetrini in acqua distillata per 1 min. </li><li> Diapositive asciugare completamente in un ambiente privo di polvere o mettendo in forno a 40-60 ° C per 30-60 minuti o mantenendo notte a temperatura ambiente. </li><li> Incubare i vetrini in soluzione polilisina (che comprende parti unfrosted) il rocker per 15 min. </li><li> Ripetere l&#39;asciugatura dei vetrini. </li><li> Ripetere polilisina soluzione di incubazione e fasi di essiccazione. </li><li> Separare le diapositive utilizzando un oggetto metallico sottile come una spatola di pesatura sottile. Se sono correttamente rispettate, sono difficili da separare. Indossare appropriato equipaggiamento di sicurezza (occhiali) e lavorare su carta da banco (deve essere scartata dopo l&#39;uso), dal momento che piccoli frammenti di vetro possono volare sciolto quando le diapositive sono separati. </li><li> Conservare i vetrini in pulito(Privo di polvere), box scorrevole a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 1C. Far scorrere una preparazione ottimale per la fissazione di formaldeide Massima adesione ma di alta sfondo. <ol><li> Collocare i vetrini preparati con il metodo 1B appartamento in una pirofila-safe senza polvere (per l&#39;asciugatura in forno) o su una superficie piatta priva di polvere (per l&#39;essiccazione all&#39;aria). </li><li> Mettere una goccia 20-60 ml di soluzione di polilisina al centro di ogni diapositiva. </li><li> Diapositive asciugare completamente in forno oppure a temperatura ambiente. Il polilisina si lascerà alle spalle ovali pallidi man mano che evapora. Questi ovali sono molto adesivo. Purtroppo, anche legano agli anticorpi primari e secondari, anche dopo il blocco. </li><li> Conservare i vetrini in pulito casella di scorrimento (senza polvere) a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione del congelato Nematode Slides Preparare nematodi per la colorazione da risciacquo completamente privo di batteri utilizzando il metodo 2A (per le piastre di nematodi) o2B (per singoli nematodi). 2A. Preparazione delle diapositive da lastre di nematodi <ol><li> Posizionare un pezzo di metallo in ghiaccio secco a pre-raffreddamento. </li><li> Utilizzare acqua distillata e una pipetta di vetro (diminuisce la perdita di vermi) o micropipetta per sciacquare i vermi da piastra NGM con i batteri in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. Le piastre possono essere sincronizzati o mescolati età, non utilizzare piatti con molti dauers (difficili da decifrare) o vermi affamati (aumento di autofluorescenza) a meno necessario. </li><li> Sciacquare i vermi a 3 4x con acqua distillata fino priva di batteri. (Per diminuire la perdita di vermi utilizzare la stessa pipetta di vetro.) Per far sedimentare i vermi, né lasciarli seduti in panchina per 3-5 minuti (per raccogliere lo più gli adulti sul fondo della provetta) o girare 30 secondi a ~ 1.000 giri (~ 500 g) in una centrifuga da tavolo (per raccogliere gli adulti, larva, ed embrioni). </li><li> Rimuovere la maggior parte dell&#39;acqua dal tubo di vermi, lasciando circa il doppio del volume di acqua come vermi (ma almeno 25 pl di volume totale). </li><li&gt; Etichetta lato opaco del &quot;bottom&quot; (trattato al punto 1) slides polilisina con indelebili scivoli inchiostro e posto sul bancone accanto al contenitore con ghiaccio secco, etichetta verso l&#39;alto. </li><li> Avere un numero uguale di regolari (ripulito ma non trattati polilisina) slides &quot;top&quot; disponibili. </li><li> Posto ~ 25 microlitri vermi in acqua su &quot;basso&quot; scivolo aderente e diffondere il liquido contenente i vermi sulla porzione centrale della slitta utilizzando il lato della punta della pipetta. </li><li> Lasciate che i vermi accontentarsi di 30 sec a 2 min. Se la diapositiva è opportunamente appiccicoso, le estremità dei vermi si attaccano come contattare la diapositiva. </li><li> Tenere la slitta inferiore in una mano e posizionare la slitta superiore sul vetrino fondo in modo che tutte le parti gelate ma si sovrappongono. Il liquido dovrebbe mantenere le diapositive leggermente divaricate, in modo che i vermi ancora si muovono leggermente Non lasciate che i vetrini scivolare uno sopra l&#39;altro -. Questa stravolge i vermi. </li><li> Premere delicatamente verso il basso sleggermente sulla slitta superiore, utilizzando il pollice e l&#39;indice di ciascuna mano. Con la quantità ideale di pressione, alcune delle più grandi ermafroditi sul bordo delle slitte si romperà, mentre la maggior parte degli adulti e delle larve saranno contattare ciascun vetrino ma rimarrà intatta. </li><li> Immediatamente e accuratamente (senza scivolare) mettere i vetrini sul pezzo di metallo in ghiaccio secco. I vetrini devono apparire congelato entro un minuto. Continuate a ghiaccio secco per 5 minuti fino al completo congelati. </li><li> A questo punto, i vetrini possono essere conservati in un contenitore etichettato a -80 ° C per diversi giorni. (Se sono tenuti settimane a -80 ° C, l&#39;acqua inizierà a sublimare via e vermi non macchia pure). Se i vetrini vengono conservati a -80 ° C, far loro &#39;riscaldano&#39; in ghiaccio secco per 10 minuti prima di cracking. </li><li> Passare al punto 3 (fissazione). </li></ol> 2B. Preparazione di diapositive di singoli nematodi <ol><li> Posizionare un pezzo di metallo in ghiaccio secco a preccollina. </li><li> Utilizzare un pick worm per trasferire singoli nematodi ad una goccia d&#39;acqua su una piastra NGM per liberarli dai batteri. Nematode (s) deve essere ben nutrito per diminuire autofluorescenza, se possibile. Ripetere il trasferimento di nuove macchie di acqua se necessario fino a vite senza fine (s) sono privi di batteri. </li><li> Etichettare lato opaco dei &quot;peggiori&quot; scivola polilisina con indelebili scivoli inchiostro e posto sul bancone accanto al contenitore con ghiaccio secco, etichetta verso l&#39;alto. Avere un numero uguale di meno aderente &quot;top&quot; (non trattati) slides disponibili. </li><li> Collocare un 5-10 microlitri goccia d&#39;acqua sulla regione della slitta inferiore doppio trattato con polilisina. Utilizzare il volume maggiore se il trasferimento più vermi, per evitare che l&#39;acqua evapori prima del completamento. </li><li> Trasferire il worm (s) alla goccia d&#39;acqua con il pick verme, utilizzando il microscopio a guardare come i vermi affondano a toccare la superficie del vetrino appiccicosa. Trasferimento da un minimo di un worm di ben 20 + vermi a goccia. </li><li> Tenere le s fondolide in una mano e posizionare la slitta superiore sul vetrino fondo in modo che tutte le parti gelate ma si sovrappongono. </li><li> Immediatamente e con attenzione (senza scivolare o comprimere) mettere le diapositive sul pezzo di metallo in ghiaccio secco. Tenere in ghiaccio secco per 5-30 min. (Non conservare queste diapositive a lungo termine, come le diapositive facilmente asciugare.) </li><li> Passare al punto 3 (fissazione). </li></ol> 3. Fissazione Fissativi sono necessarie per &#39;fix&#39; l&#39;antigene nel posto nella cella, da una precipitante (&quot;fissazione luce&quot;) o cross-linking (&quot;fissazione duro&quot;) l&#39;antigene. Fissazione può interrompere antigenicità; anticorpi più conosciuti funzionano meglio con una particolare condizione di fissazione. Per i nuovi anticorpi, una serie di condizioni di fissaggio deve essere testato. Per qualsiasi fissaggio, il primo passo è quello di rendere soluzione salina tamponata con fosfato. Prossime diapositive fix nematodi per gli anticorpi colorazione utilizzando il metodo A (lucefissare con metanolo e acetone) o B (fix più difficile con formaldeide o glutaraldeide). <ol><li> Preparare una sterile 10x PBS (tampone fosfato) stock soluzione aggiungendo 80 g di NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g di Na 2 HPO 4 • H 2 0, 2,4 g di KH 2 PO 4, 20 ml al 10% di sodio azide magazzino. Per rendere questa soluzione, pesare sodio azide polvere per rendere soluzione al 10% in acqua bidistillata. Mescolare salina con calore dolce fino alla dissoluzione. ATTENZIONE: secco sodio azide è reattivo e tutte le forme sono tossici. Indossare una maschera e guanti quando si lavora con azide di sodio secco o soluzioni. </li><li> Sia salina fredda (Tris pH è sensibile alla temperatura), quindi il pH a 7.2 con 1-10 M NaOH. Top a 1 L con acqua bidistillata e autoclave per la sterilizzazione. Conservare a temperatura ambiente e portare a 1x, se necessario, con acqua distillata doppio sterile. ATTENZIONE: NaOH è caustico - indossare guanti durante l&#39;uso. </li></ol> 3A. Fix luce utilizzando metanolo-acetone <ol><li> Mettere metanolo 100%, 100% acetone, e 1x tampone fosfato salino (PBS) in vaschette per colorazione di pre-raffreddamento in ghiaccio per almeno 10 min. ATTENZIONE: metanolo e acetone sono tossici, indossare i guanti. </li><li> Prendete un paio di inferiore e superiore diapositive dal ghiaccio secco, rapidamente li torcere a parte, e immergere subito la diapositiva &quot;dal basso&quot; in ghiaccio metanolo freddo per 2 min. La slitta &quot;top&quot; può essere scartata. </li><li> Trasferire i vetrini da metanolo per ghiaccio acetone freddo per 4 min. Se i vetrini avevano molti vermi, la maggior parte (90%) si cadere nella correzione, anche con le diapositive meglio preparati. Se i vetrini singoli vermi sono stati adeguatamente preparati, i vermi dovrebbero rimanere aderito. </li><li> Posizionare o immergere i vetrini nel vaso con PBS (per risciacquare fissativo) e passare al punto 4 (colorazione). </li></ol> 3B. Fix duro con formaldeide o glutaraldeide <ol><li> Diluire grado di formaldeide reagente o soluzione di glutaraldeide in PBS 1x a concentrazione finale 0,5-4%. Aliquote (1,5 ml) may essere conservato ben chiuso a -20 a -30 ° C; scongelare aliquote su ghiaccio poco prima dell&#39;uso. NOTA: Le soluzioni di formaldeide degradano nel tempo e con l&#39;esposizione all&#39;aria. ATTENZIONE: formaldeide e glutaraldeide sono tossici, indossare guanti e lavorare nel cappuccio. </li><li> Prendete un paio di inferiore e superiore diapositive dal ghiaccio secco, rapidamente li torcere a parte, e collocare immediatamente l&#39;slide &quot;basso&quot; con i vermi nel piatto piatto con coperchio. (La slitta superiore può essere scartato). </li><li> Pipettare immediatamente 200 microlitri fissativo tossico sul centro della superficie del vetrino con vermi. Il fissativo sarà parzialmente congelare sul posto, poi sciogliere per coprire una regione più ampia della diapositiva. </li><li> Se i vermi non sono totalmente coperti con fissativo, immediatamente e accuratamente aggiungere più fissativo utilizzando una micropipetta. Non permettere fissativo di scendere oltre il bordo della diapositiva. </li><li> Coprire il piatto con un coperchio e lasciar riposare per 10 minuti durante la notte a temperatura ambiente. Assicurarsi che il piatto viene umidificata se incubazione più lunghi are usata - questo può essere fatto con l&#39;aggiunta di salviette filacciosi bagnato piegati al piatto. Non lasciate che le salviettine toccare le diapositive. </li><li> Dopo la fissazione è completa, pipetta accuratamente il fissativo con i vermi sciolti in una provetta da 1,5 ml e immergerlo in una vaschetta di colorazione con PBS. </li><li> Gira il tubo con i vermi che venivano sciolti ad alta velocità per 30 secondi a pellet. Risciacquare i vermi due volte con PBS, poi elaborare in parallelo con i vermi sui vetrini (facendo passi in provette per microcentrifuga, piuttosto che sui vetrini). </li><li> Passare al punto 4 (colorazione). </li></ol> 4. Anticorpo colorazione Il protocollo di colorazione anticorpale è simile ai protocolli standard per qualsiasi tessuto su vetrini. Questo protocollo è uguale per tutte le diapositive indipendentemente dalla preparazione nei passaggi 1-3. <ol><li> Preparare Antibody Buffer miscelando 700 ml di acqua bidistillata, 100 ml 10x PBS, 5 ml di Triton X-100 (0,5% finale), 2 ml di 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM finale), 1 g BSA (0,1% finale), 5 ml 10% az sodiosoluzione ide (0,05% finale). pH a 7.2 con HCl, quindi aggiungere acqua bidistillata a 1 L; conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare Block ricostituendo siero asino con acqua bidistillata, quindi aggiungendo siero 5 ml a 45 ml di tampone di anticorpo (siero finale 10%). </li><li> Preparare primarie e secondarie soluzioni di anticorpi diluendo nel tampone dell&#39;anticorpo più 1% BSA. Diluizioni consigliate sono 1:50-1:2,000 per gli anticorpi primari e 1:1,000-1:5,000 per anticorpi secondari (Cy3or OG488 anticorpi asino coniugati contro le specie utilizzate per sollevare anticorpo primario). </li><li> Preparare DAPI magazzino mescolando 2,5 mg / ml in acqua bidistillata; negozio in 8 microlitri aliquote congelate a -30 ° C. ATTENZIONE: DAPI è un colorante legame al DNA tossici, indossare i guanti durante la pesatura e dosaggio in aliquote. </li><li> Preparare 10 ml Piano di montaggio, mescolando 200 mg n-propile gallato, 0.3 ml di 1 M Tris pH 9, 2.7 ml di acqua distillata in una provetta da 15 ml. Riscaldare a 65 ° C per circa 10 minuti fino a completa dissoluzione.Aggiungere 7 ml di glicerolo e un&#39;aliquota 8 ml di DAPI e vortex bene. Medio Aliquota in provette da 1,5 ml, avvolgere in un foglio, e conservare al buio a 4 ° C (sia aria e luce degradano il medium - se diventa più giallo, scartare nei rifiuti Biohazard). ATTENZIONE: n-propil gallato è un reattivo anti-ossidante, indossare guanti durante la pesatura. </li><li> Trasferire i vetrini in una vaschetta di colorazione con il blocco per 1 ora a temperatura ambiente o una notte a 4 ° C (durante la notte preferibile per il disco fisso). Evitare di agitazione per evitare di perdere i vermi. </li><li> Trasferire i vetrini per la colorazione vaso con anticorpo primario o mettere i vetrini appartamento in un piatto umidificata e top ciascuno con 100-500 anticorpo primario microlitri. Incubare i vetrini una notte a 4 ° C senza agitazione. </li><li> Dopo l&#39;anticorpo primario incubazione, trasferimento scivola alle macchie barattolo di PBS. </li><li> Filtro di blocco tramite imbuto foderato con carta da filtro e conservare a 4 ° C; se sterili filtrati ogni 1-2 settimane, Block può essere riutilizzato per uno o più mesi. Allo stesso modo, filtrare e salvareanticorpo primario a 4 ° C per il riutilizzo (fino a 10 o più giri di colorazione). </li><li> Sciacquare i vetrini tre volte (~ 20 min ciascuna) in tampone dell&#39;anticorpo. </li><li> Porre i vetrini in anticorpo secondario in un contenitore a tenuta di luce di colorazione e incubare 4 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Trasferire i vetrini per la colorazione barattolo di PBS. Filtro e salvare anticorpo secondario a 4 ° C per il riutilizzo (fino a 10 o più giri di colorazione). </li><li> Sciacquare i vetrini tre volte (~ 20 min ciascuna) in tampone dell&#39;anticorpo. </li><li> Trasferire i vetrini di PBS e lasciate in PBS (minuti per una notte a 4 ° C) fino al momento di montare. </li><li> Lavorare rapidamente sulle singole diapositive, in modo che i vermi sulla parte anteriore del vetrino rimanere bagnato. Rimuovere un vetrino dal PBS, asciugare retro del vetrino con un libero di lanugine pulire, e posto su un tovagliolo di carta. </li><li> Luogo ~ 20 ml di mezzo di montaggio sopra i vermi in modo che non vi siano parti approssimativamente uguali medie e PBS sulla trasparenza e l&#39;inclinazione scorrevole delicatamente per miscelare le due soluzioni. CAUTION: Montaggio medio è tossico. </li><li> Tilt diapositiva bordo in modo smerigliato è più basso e la soluzione raccoglie nei pressi di glassa, poi mettere un bordo di 24 x 60 mm coprioggetto sulla soluzione. </li><li> Abbassare delicatamente il vetrino per ridurre al minimo le bolle d&#39;aria (che aumentano il candeggio e interrompono la visione). Se si formano bolle, sollevare il bordo del vetrino lentamente, poi relower senza scivolare il vetrino di tutti i vermi. </li><li> Asciugare con cura il bordo della diapositiva senza spostare il vetrino, comprimendo i bordi con un libero di lanugine pulire. Il bordo relativamente secco del vetrino deve essere visibile in tutto il bordo del vetrino </li><li> Sigillare il vetrino con 2-3 strati di smalto. I vetrini possono essere collocati in un portavetrini piatto durante la preparazione e la conservazione al riparo dalla luce. Una diapositiva è ben sigillato e asciutto, pulire il vetrino e posteriore della diapositiva. </li><li> Vetrini ben sigillati possono essere conservati al buio per giorni a settimane, 4 ° C oa -20 ° C. Più di periodi più lunghi, DAPI staining del DNA e la maggior parte dei coloranti verdi (ad esempio 488 nm di eccitazione) dissolvenza. Richiudere il vetrino con più smalto, se necessario, ad esempio, dopo l&#39;utilizzo di qualsiasi obiettivo immersione in olio. </li></ol>

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L&#39;autore dichiara che lei non ha interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo di congelamento di cracking è uno dei diversi metodi per la colorazione degli anticorpi in C. elegans. Esso fornisce un modo relativamente semplice per colorare i vermi, ma richiede reagenti specifici e pratica per ottenere risultati ottimali. Passaggi critici (descritti nella Figura 1) includono: 1) preparazione del vetrino (vedi punti 1 e 2) la compressione manuale dei nematodi (vedere i passi 2 e 3) di fissaggio rapido (vedi punto 3). In primo luogo, per massimizzare l&#39;ade...

Per determinare la localizzazione cellulare e subcellulare di proteine, gli scienziati hanno tradizionalmente etichettati tessuti con anticorpi selezionati per riconoscere specificamente particolari proteine ​​1. In alcuni organismi modello come C. elegans, colorazione anticorpale è stato spesso sostituito da tecniche genetiche molecolari, che danno risultati più rapidamente. Questi includono organismi trasformante con costrutti costituiti da fusioni geniche tra il promotore e regioni codificanti del gene di interesse e proteina fluorescente verde. Tuttavia, le tecniche molecolari sono soggette a una serie di manufatti, compresi i problemi connessi conoscere il vero promotore e cambiamenti nell&#39;espressione di costrutti ad alto numero di copie (le usuali tecniche di C. elegans) 2,3. Pertanto, la colorazione con anticorpi rimane un obiettivo per molti scienziati che studiano la funzione delle proteine ​​in vivo. Colorazione tessuti con anticorpi può essere difficile, in quanto untibodies possono riconoscere solo la loro antigene in una particolare conformazione 1. Ad esempio, gli anticorpi possono riconoscere solo antigene denaturato o intatta fissato in modo particolare e non possono riconoscere l&#39;antigene in situ. Il problema di colorazione anticorpale nei nematodi è aggravata dal fatto che la cuticola del nematode forma una barriera relativamente impermeabile, bloccando l&#39;accesso di anticorpi ai tessuti. Ci sono diversi metodi utilizzati per la colorazione degli anticorpi in C. elegans (recensito nel nostro precedente lavoro 4). Per macchiare intatti &#39;vermi, «metodi sono stati sviluppati per congelare e scongelare in un fissativo relativamente dura (formaldeide o glutaraldeide), i cicli di gelo-disgelo contribuiscono a rompere la cuticola per consentire una rapida penetrazione del fissativo 5. Dopo la fissazione, la cuticola stata permeabilizzate per consentire la penetrazione dell&#39;anticorpo; metodi inclusi il trattamento con agenti riducenti, collagenasi, o entrambi 5-7. Queste treatments conservati morfologia, ma spesso ridotti o distrutti riconoscimento anticorpale. Metodi alternativi includono dissezione 8 per consentire la penetrazione anticorpo. &quot;Freeze-cracking&quot; è un modo per ottenere l&#39;accesso all&#39;interno del verme semi-intatte per consentire colorazione anticorpale 9-10. Freeze-fessurazione può essere eseguita con una varietà di condizioni di fissaggio evitando trattamenti collagenasi e di riduzione. I nematodi sono posti tra due adesivi diapositive, congelati e quindi i vetrini sono separati, lasciando la maggior parte del nematode sul vetrino fondo e gran parte della cuticola sulla slitta superiore. La slitta inferiore può essere posizionato in fissativo e l&#39;intera diapositiva da nematodi aderito viene trasferita attraverso la procedura di colorazione anticorpale. Il metodo non presentano due grandi difficoltà. In primo luogo, è difficile applicare la giusta quantità di pressione necessaria per dividere i nematodi senza deformarli seriamente. In secondo luogo, molti dei vermi non sarà stick a uno scivolo, e sarà perso nel fissativo o risciacqui. Tuttavia, con le diapositive e prassi corrette, il metodo rapidamente produrre nematodi con ragionevole morfologia che può essere utilizzato con una vasta gamma di fissativi e anticorpi. Il metodo può essere leggermente variato, a seconda della porta dello sperimentatore. Se si desidera una colorazione di singoli nematodi (ad esempio per determinare se un singolo trasformante ha modificato colorazione anticorpale), poi scivola con adesione massima (ma superiore colorazione di fondo) può essere utilizzato, ad esempio diapositive-laboratorio preparati con polilisina supplementare (vedi sotto). Per formaldeide o fissazione glutaraldeide, diapositive di adesione superiori (slides polilisina-laboratorio preparati) devono essere utilizzati, dal momento che i nematodi aderiscono più male di polilisina dopo queste fissazioni. Se wild-type nematodi sono stati fissati con metanolo e / o acetone, poi scivola con l&#39;adesione sempre più in basso la colorazione di fondo deve essere utilizzato (commerciale oppure lvetrini aboratory preparati). Se una varietà di anticorpi e fissativi sono utilizzati nel laboratorio, una selezione di diapositive può essere preparato in anticipo e conservato fino al momento dell&#39;uso. Dopo l&#39;accesso al tessuto nematode è stata acquisita, le procedure di anticorpi colorazione seguono metodi standard (con incubazione più caratteristici dei tessuti, piuttosto che le cellule 1,11).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine slide (ESCO brand)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-78</td>
			<td>Sigma brand slides also suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1524</td>
			<td>IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>single frosted edge slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>48312-002</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>coplin staining jar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47751-792</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-slide mailer</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71549-01</td>
			<td>One of many different brands of small slide holder, suitable for staining</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MK262159</td>
			<td>IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde solution, 25% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G 5882</td>
			<td>IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-9410</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN820451</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Serum, lyophilized</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td>This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>n-propyl gallate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>ICN10274750</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI, 4',6'-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 9542</td>
			<td>TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Whatman #1 15 cm diameter filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09805G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-252</td>
			<td>#1 1/2 thickness is optically best</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microscope slide folder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48429-092</td>
			<td>Other brands are suitable</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

antibody staining in c. elegans using &quot;freeze-cracking&quot;

Per macchiare C. elegans con anticorpi, la cuticola relativamente impermeabile devono essere aggirati con metodi chimici o meccanici. &quot;Freeze-cracking&quot; è un metodo utilizzato per estrarre fisicamente la cuticola da nematodi comprimendo nematodi tra due diapositive aderenti, il congelamento, e tirando le diapositive a parte. Freeze-fessurazione fornisce un modo semplice e rapido per ottenere l&#39;accesso ai tessuti senza trattamenti chimici e può essere utilizzato con una varietà di fissativi. Tuttavia, porta alla perdita di molti dei campioni e la compressione richiesta distorce meccanicamente il campione. La pratica è necessaria per massimizzare il recupero di campioni con buona morfologia. Freeze-fessurazione può essere ottimizzato per le condizioni specifiche di fissazione, recupero di campioni, o bassa colorazione non specifica, ma non per tutti i parametri contemporaneamente. Per gli anticorpi che richiedono condizioni di fissazione molto duri e tollerano i trattamenti chimici necessari per permeabilize chimicamente la cuticola, treatment di nematodi intatte in soluzione può essere preferito. Se l&#39;anticorpo richiede una correzione chiara o se le condizioni ottimali di fissaggio sono sconosciute, liofilizzazione di cracking fornisce un modo molto utile per saggiare rapidamente l&#39;anticorpo e può produrre specifiche informazioni di localizzazione subcellulare e cellulare per l&#39;antigene di interesse.

Quando i vermi sono adeguatamente compressi, incrinato, e leggermente fissi, praticamente l&#39;intero worm può essere accessibile a colorazione anticorpale (vedi figura 2). La posizione dei nuclei come indicato dalla colorazione DAPI indica quali parti del verme sono intatti Quando i vermi sono sottoposti ad un fissativo più duro, come la formaldeide, la morfologia della vite senza fine può essere distorta (come si vede dalla comparsa innaturale ondulata del muscoli nelle figure 3a-D).</stro...

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Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

&quot;Freeze-cracking,&quot; un metodo per esporre i tessuti interni del nematode C. elegans di anticorpi per la localizzazione delle proteine, è dimostrata.

Antibody colorazione in<em&gt; C. Elegans</em&gt; Uso di &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

22.5K Views.  Ohio University.  "Freeze-cracking," un metodo per esporre i tessuti interni del nematode C. elegans di anticorpi per la localizzazione delle proteine, è dimostrata. 

Video: Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Ricerca

Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Metodo per la colorazione intero anticorpi Monte a Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Chemiotassi Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Metodi di valutazione subcellulari Compartimenti di muscoli in<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Monitoraggio e quantificazione processi di sviluppo in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo strumenti open-source

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Misurazioni delle risposte allo stress fisiologico in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...