I peptidi RAN sono una caratteristica dei disturbi neurodegenerativi di espansione ripetuta come la malattia di Huntington, la sclerosi laterale amiotrofica e la demenza frontotemporale. Questi protocolli forniscono un importante approccio standardizzato per quantificare la tossicità dei peptidi RAN nel sistema di modelli C.elegans. Le tecniche descritte sono semplici da imparare ed economiche, possono essere eseguite rapidamente e sfruttano le caratteristiche riproducibili del sistema C.elegans come il movimento e la riproduzione.
Quando si tenta questo protocollo, la sfida principale è ottenere tossicità ed espressione costante del peptide RAN. I principali fattori da controllare includono la temperatura del farmaco, la tempistica dei turni di temperatura e la preparazione delle piastre di dosaggio. È importante che gli sperimentatori classifichino costantemente i fenotipi degli animali in questo saggio di processo dipendente dall'età.
La dimostrazione visiva di questa tecnica mostra i loro criteri di classificazione. Inizia versando il mezzo standard di crescita del nematode con un IPTG millimolare e 25 microgrammi per carbenicillina millilitro in piastre a 24 pozzetti. Striare RNAi nutrendo cloni in batteri HT115 su agar di carbenicillina LB e coltivali a 37 gradi Celsius per 24 ore.
Il giorno successivo, scegli una singola colonia in un millilitro di liquido di carbenicillina LB e fai crescere i batteri per 18 ore a 37 gradi Celsius mentre tremi a 250 giri/min. Individua quattro singoli pozzi della piastra ngm RNAi 24-well con 20 microlitri di colture batteriche durante la notte come descritto nel manoscritto testuale e consenti ai batteri RNAi di indurre la produzione di RNA a doppio filamento durante la notte. Utilizzare il metodo standard dell'ipoclorito per isolare le uova dal primo giorno di C.elegans adulti che esprimono il transgene peptidico RAN integrato.
Quindi seminare circa 30 uova in ogni pozzo del piatto di 24 pozzi e incubare il piatto a 20 gradi Celsius per sette giorni. Per eseguire l'analisi della velocità video, acquisire due video da due pozzi separati per ogni condizione RNAi utilizzando un microscopio stereo sezionato dotato di una fotocamera monocromatica. Assicurarsi di utilizzare impostazioni di acquisizione coerenti tra i pozzi.
Per ogni video, impostare la durata per 10 secondi e l'intervallo di tempo su 76 millisecondi. Impostare il tempo di esposizione dell'immagine su quattro millisecondi e usare l'impostazione di zoom 1,49. Quindi selezionare due per due binning.
Verificare che la risoluzione sia di 800 per 600 pixel e iniziare la registrazione. Dopo l'acquisizione, etichettare immediatamente ogni video con la deformazione, la condizione RNAi e il numero del pozzo. Quindi misurare la distanza percorsa e la lunghezza di ogni animale per 20 animali diversi per video, esaminando un totale di circa 40 vermi per ogni condizione RNAi.
Nel software selezionare il pulsante degli strumenti di annotazione. Quindi lo strumento di testo di disegno. Fare clic su un punto al centro del worm misurato nel primo fotogramma del video e contrassegnarlo con un numero.
Avanzare il video fino alla fine mentre si traccia visivamente il worm. Quindi fai clic su di esso e contrassegnalo con il numero corrispondente successivo. Utilizzare lo strumento barra di scala di disegno per disegnare una linea dal primo al secondo numero e registrare la distanza percorsa in un foglio di calcolo.
Ripetere questa misurazione per altri 19 worm nel video mantenendo ogni singola misurazione nella finestra di analisi. Una volta completate le misurazioni, scatta un'istantanea del fotogramma video finale che illustra tutte le linee di misurazione in modo che i dati possano essere ricondotti all'animale da cui provengono. Analizzare quindi i dati utilizzando un foglio di calcolo a quattro colonne in cui la colonna uno è l'identificatore del worm e la colonna due è la velocità.
Il tempo di ogni video può essere trovato facendo clic con il pulsante destro del mouse sul video sotto l'esperimento e andando alle proprietà. Per normalizzare la misurazione della velocità, trova la lunghezza di ogni animale. Utilizzare lo strumento di disegno polilinea per tracciare liberamente i C.elegans dalla punta della testa alla punta della coda.
Quindi scatta un'istantanea del fotogramma video finale che illustra tutte le polilinee. La lunghezza delle linee sarà registrata sotto le statistiche. Aggiungere due colonne al foglio di calcolo, una per la lunghezza degli animali e una per la velocità normalizzata.
Infine, analizzare i dati di velocità normalizzati utilizzando un ANOVA unidirevio con test post-hoc rispetto al vettore vuoto RNAi. Posizionare da quattro a sei C.elegans transgenici L4 che esprimono GFP peptidico RAN su una piastra GFP RNAi di sei centimetri e coltivarli a 20 gradi Celsius. Se l'esperimento utilizza RNAi per testare gli effetti genetici sulla tossicità dei peptidi RAN, spostare 10 adulti gravidi transgenici in ciascuna delle due piastre RNAi GFP RNAi o RNAi specifiche del gene.
Se i mutanti vengono utilizzati per analizzare gli effetti genetici sulla tossicità dei peptidi RAN, posizionare 10 animali gravidi di tipo selvatico o mutanti che esprimono lo stesso transgene RAN su ciascuna delle due placche RNAi o GFP RNAi vettoriali vuote. Coltivali a 20 gradi Celsius per 48 ore. Scegli 10 set di 10 L4 transgenici dalle piastre RNAi e posiziona ogni set su una piastra RNAi di tre centimetri.
Assicurarsi che i vermi selezionati per il saggio abbiano tutti una motilità superficialmente normale. Mettere i piatti in un sacchetto di plastica per trattenere l'umidità e incubarli a 25 gradi Celsius. Dopo 24 ore, analizzare gli animali per la mobilità toccando le piastre sul microscopio sezionante e controllando il movimento.
Se un verme si muove per più di una lunghezza del corpo, contalo come mobile e trasferiscilo su una nuova piastra RNAi di tre centimetri. Usa un piccone di platino per toccare i vermi rimanenti sulla testa e sulla coda. Se l'animale si muove per più di una lunghezza del corpo, conta l'animale come mobile e trasferiscilo su una nuova piastra RNAi di tre centimetri.
Se la paralisi significativa non si osserva nel controllo vettoriale vuoto entro il secondo giorno, terminare il saggio e ricominciare da capo. Raggruppa tutti i vermi nonmovibili in modo che il movimento di più di una lunghezza del corpo possa essere facilmente rilevato. Contare tutti i vermi paralizzati, insaccati o morti e scartare il piatto.
Continua a segnare gli animali per la paralisi ogni giorno per cinque o sette giorni. Il test di crescita è stato utilizzato per misurare l'effetto delle inibizioni geniche sulla tossicità dei dipeptidi RAN che si trovano nei pazienti affetti da SRIA con un'espansione ripetuta del G4C2. L'espressione di PR50 GFP da sola ha portato a un arresto completo della crescita, ma l'abbattimento di diversi geni ha soppresso la tossicità dello sviluppo.
L'effetto di specifiche eliminazioni geniche sulla motilità dello sviluppo degli animali che esprimono PR50 è stato misurato utilizzando il metodo di analisi della velocità video. Come previsto, l'inibizione dell'espressione di PR50 GFP ha portato a un grande aumento della motilità rispetto al vettore vuoto RNAi. Inoltre, l'RNAi contro la proteasome subunit RPN7 ha portato al significativo aumento della motilità pr50.
Quando i fenotipi adulti sono stati analizzati con il test di paralisi dipendente dall'età, PR50 GFP ha mostrato fino all'80% di paralisi entro cinque giorni di età. Tuttavia, RNAi ha diretto al gene cul-6 una paralisi significativamente ritardata suggerendo che il cul-6 è necessario per la tossicità pr50 GFP. Per determinare se le proteine RAN causano neuropatologia quando espresse nei neuroni C.elegans, la tossicità specifica dei neuroni è stata esaminata usando il saggio di commissure.
Nel secondo giorno gli adulti, l'espressione di PR50 GFP nei motoneuroni ha portato a un aumento significativo del sanguinamento dei motoneuroni. Questa neuropatologia è stata significativamente soppressa da una mutazione nel gene del recettore IGF dell'insulina DAF-2 che ritarda le proprietà tossiche di diverse proteine neurodegenerative. Per il saggio comportamentale, è importante che i peptidi RAN producano un fenotipo altamente penetrativo.
Tali geni o farmaci potrebbero fornire nuovi biomarcatori o opzioni terapeutiche per le malattie peptidiche RAN. Usando questi test, abbiamo eseguito uno schermo RNAi a livello genomico per soppressori della prolina-arginina peptidica RAN associata al C9ORF72. I geni identificati in questo schermo includono molti geni nuovi e conservati che saranno oggetto di futuri studi meccanicistici.
