Questi metodi possono essere utilizzati per caratterizzare le risposte allo stress nei C.elegans e per determinare se le perturbazioni genetiche o farmacologiche influenzano l'attivazione di vie cellulari protettive. Questi metodi consentono test rapidi e ad alta produttività di centinaia di perturbazioni come l'abbattimento genico sia a livello molecolare che fisiologico. Per garantire che il test sia eseguito correttamente, includere controlli positivi e negativi.
Sincronizza animali sani e ben nutriti con lo stadio corretto e usa piatti freschi per l'esperimento. La visualizzazione della micromanipolazione dei worm con un piccone può aiutare i nuovi utenti a capire come i worm possono essere allineati e valutati per la vitalità. A dimostrare le procedure saranno Phil Frankino, Holly Gildea e Melissa Metcalf, studentesse laureate nel nostro laboratorio.
Utilizzare animali che esprimono GFP sotto il promotore della proteina shock termico quattro per l'attivazione della risposta proteica spiegata al reticolo endoplasmatico, far crescere gli animali reporter sincronizzati a 20 gradi Celsius fino allo stadio L4 e lavare i vermi dal piatto usando il mezzo M9 e trasferirli in un tubo. Dopo aver raccolto i vermi per centrifugazione, sostituire l'M9 con 25 nanogrammi per millilitro del farmaco di interesse per M9 o solfossido di dimetile in M9 nei tubi animali di controllo. Quindi posizionare i vermi su una piattaforma rotante per tre o quattro ore a 20 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, centrifugare i vermi per depositarsi prima di sostituire la soluzione di trattamento con 15 millilitri di M9 da solo. Dopo due lavaggi, trasferire gli animali su piastre NGM o piastre di interferenza NGM RNA a seconda dei casi e consentire ai vermi di riprendersi durante la notte a 20 gradi Celsius. Una volta che i vermi si sono ripresi, aggiungere da cinque a 10 microlitri di azide di sodio da 100 millimolare su una piastra NGM standard senza batteri e posizionare una piastra di vermi al microscopio sezionato.
Trasferire da 10 a 20 animali dal piatto nel punto di azide di sodio. Gli animali dovrebbero impadronirsi del movimento poco dopo l'atterraggio nella soluzione salina. Una volta che l'azide di sodio è evaporato, allineare gli animali nella configurazione di imaging desiderata con i lati anteriore e posteriore nello stesso orientamento per tutti gli animali e posizionare immediatamente la piastra degli animali al microscopio stereo.
Avviare il software di imaging al microscopio stereo e nella scheda acquisizioni fare clic su apri progetti e cartella per aprire un nuovo progetto. Fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere rinomina per rinominare la cartella. Posizionare il campione di worm sotto l'obiettivo del microscopio e utilizzare l'impostazione Brightfield per individuare il punto focale corretto dei vermi per ridurre al minimo lo sbiancamento fluorescente.
Il centro del campione sarà il punto in cui la linea di uova è chiaramente visibile e non sfocata. Impostare il tempo di esposizione per garantire che i pixel non siano saturi e anche per garantire che il segnale sia al di sopra del limite di rilevamento. Dopo aver impostando i condensatori di tempo di esposizione, zoom, messa a fuoco e Brightfield sulle impostazioni appropriate, fare clic sul pulsante acquisisci immagine per acquisire un'immagine.
Per l'imaging utilizzando un microscopio a campo largo composto, posizionare la piastra di trattamento del controllo di base sullo stadio del microscopio a campo largo composto e utilizzare il touch pad per avviare il programma di controllo. Create un nuovo album e nome file e posizionate la piastra sotto l'obiettivo. Utilizzare il controllo di base e le piastre di controllo positive per impostare il tempo di esposizione e l'intensità della fluorescenza in modo che il segnale sia visibile ma non saturo.
Quindi salva le immagini FITC Brightfield e GFP. Per quantificare l'induzione del reporter da parte della citometria a flusso di particelle di grandi dimensioni, prima accendere i laser del citometro e aprire il software del citometro. Fare clic sul pulsante start per attivare i laser nella finestra del software e scegliere Esegui per avviare il laser nella finestra popup di controllo laser argon.
Quando il laser raggiunge circa 12 milliwatt e il livello della sorgente luminosa 488 sale a circa 12, fare clic e controllare i quattro valori di pressione. Se i valori sono simili a quelli osservati nella configurazione originale, selezionare la casella pressione OK. Successivamente, per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria o detriti che bloccano il flusso di fante e campionare attraverso la cella di flusso, fare clic su pulisci più volte.
Quindi disattivare l'ordinamento e attivare la trana per riavviare il flusso. Per controllare la portata, raccogli la tona per 60 secondi. Raccogliere la trana in un tubo da 15 millilitri per 60 secondi.
La portata dovrebbe essere da nove a 10 millilitri al minuto. Per eseguire i campioni, regolare la potenza del fotomoltiplicatore laser a un livello sufficientemente alto da far sì che il segnale sia superiore al limite di rilevamento ma non superiore al limite di saturazione. Eseguire la gating di dimensioni per escludere bolle, detriti, uova e altre piccole particelle indesiderate e per includere solo gli animali di interesse come gli adulti.
Una volta impostati i parametri di screening, aggiungere i worm preparati a una tazza e fare clic su acquisisci. Guarda per assicurarti che tutto il liquido non sia preso nella macchina in quanto ciò causerà l'ingresso di aria nel citometro di flusso e creerà bolle all'interno del rilevatore. Quando il campione è basso e/o sono stati raccolti abbastanza animali, fare clic su interrompi.
Per archiviare i dati gated in base solo ai vincoli di dimensione, fare clic su setup, archiviazione dati, solo gated e archiviazione gated per salvare i dati. Quindi sciacquare la tazza di raccolta con acqua deionizzata e rimuovere il lavaggio sottovuoto tre volte prima di ripetere l'analisi con il campione successivo. Per misurare la sensibilità allo stress mitocondriale e ossidativo, aggiungere da 50 a 75 microlitri di Paraquat in M9 a otto-10 pozzi per condizione di una piastra piatta del fondo da 96 pozzi e trasferire da otto a 10 vermi per condizione in ogni pozzo di Paraquat.
Ogni due ore, tocca delicatamente il piatto per far sì che gli animali vivi si thrash o si pieghino per consentire di segnare il numero di animali morti per pozzo. Per misurare la sensibilità alla temperatura degli animali, incubare i vermi per tre o quattro giorni a 20 gradi Celsius prima di placcare da 10 a 15 animali per piastra per condizione per un totale di quattro o sei piastre. Quindi posizionare le piastre in un'incubatrice di 34 o 37 gradi Celsius e segnare la sopravvivenza del verme ogni due ore come appena dimostrato.
Il reporter hsp-4 ha un'impressione basale minima in assenza di stress, ma mostra una robusta espressione GFP quando gli animali sono esposti allo stress del reticolo endoplasmatico usando il farmaco Tunicamycin. Queste differenze possono anche essere quantificate usando un grande citometro a flusso di particelle. Inoltre, l'induzione del transgene sotto stress del reticolo endoplasmatico può essere completamente sopressa dall'abbattimento di XBP-1 tramite interferenza dell'RNA.
Test simili possono essere eseguiti per misurare lo stress mitocondriale, lo stress ossidativo e lo stress da calore. Le risposte fisiologiche dell'intero animale allo stress possono anche essere misurate utilizzando diversi saggi di sopravvivenza. Ad esempio, l'esposizione alla tunicamicina viene utilizzata per misurare la sensibilità allo stress del reticolo endoplasmatico.
L'abbattimento del gene XBP-1 si traduce in un significativo aumento della sensibilità alla tunicamicina. Inoltre, l'esposizione all'agente chimico Paraquat viene utilizzata per misurare la sensibilità allo stress ossidativo e mitocondriale. Il knockdown del gene DAF-2 si traduce in un significativo aumento della resistenza al Paraquat.
La termotoleranza può essere misurata determinando la sopravvivenza degli animali a temperature elevate e può essere tracciata come una curva di sopravvivenza. Questi test devono essere eseguiti almeno da quattro a sei volte e tutte le repliche devono essere tracciate l'una contro l'altra poiché la termotoleranza dimostra una variabilità incredibilmente elevata rispetto ad altri saggi di stress. Quando si imagingno animali, è fondamentale impostare i parametri in modo che non vi sia sovra o sotto saturazione del segnale e garantire che gli stessi parametri vengano utilizzati durante l'esperimento.
I protocolli di imaging qui descritti sono suscettibili di screening su larga scala, compresi gli schermi a livello genomico, e sono ottimi sia per studi esplorativi che di conferma che possono poi essere seguiti dai saggi fisiologici descritti.
