Questo protocollo di iniezione intracranico è significativo perché consente iniezioni precise, monitoraggio giornaliero e misurazione accurata del volume tumorale per uno studio più efficace dei meccanismi della metastasi cerebrale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente il monitoraggio seriale della crescita del tumore intercraniciale. A dimostrare la procedura saranno Jonathan Spehar, ricercatore laureato presso il Laboratorio Sizemore, e Anna Bratasz, ricercatrice di imaging presso la Ohio State University Small Animal Imaging Shared Resource.
Prima di iniziare la procedura, ruotare il blocco dello stadio sul trapano per consentire l'entrata di un adattatore per punte e sterile una punta di trapano millimetro nel trapano e stringere manualmente i blocchi della punta per bloccare il trapano. Collegare il trapano al telaio stereotattico e impostare la velocità di consegna dell'iniettore digitale su 0,4 microlitri al minuto, con un obiettivo di due microlitri. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale, posizionare il mouse anestetizzato sul telaio e utilizzare l'estremità smussata di un applicatore a punta di cotone per posizionare i denti nel trogolo della barra della bocca.
Premere la barra dell'orecchio sinistra contro il canthus mediale dell'orecchio sinistro per stabilizzare il cranio e utilizzare la vite sul telaio stereotattico per bloccare il cranio in posizione. Quindi fissare l'altro lato del cranio con la barra dell'orecchio destra nello stesso modo. Per fare una finestra calvariale, pulire il cuoio capelluto con tre soluzioni sequenziali alternate di Betadine e scrub al 70% di etanolo e utilizzare un bisturi sterile per fare un'incisione di tre millimetri attraverso la pelle lungo l'aspetto mediano centrale del cranio seguendo la linea di sutura sagittale.
Identificare e orientare la punta di perforazione sterile perpendicolarmente al bregma, assicurandosi di ripristinare a zero la scala vernier digitale e spostare la punta del trapano di due millimetri lateralmente alla sutura sagittale e un millimetro anteriore alla sutura coronale. Allontanare la pelle dal trapano e utilizzare la massima velocità e prestare attenzione ai punti di riferimento, praticare con cura un foro, profondo circa 0,5 millimetri, attraverso la calvaria, raffreddando il sito di perforazione con gocce di soluzione salina sterile se necessario. Una volta effettuata la finestra calvariale, sollevare attentamente il trapano e rimuovere il trapano dal telaio stereotattico.
Per l'iniezione di cellule tumorali, collegare l'unità di iniettore automatico all'apparato stereotattico e caricare i sei-otto microlitri di cellule completamente rimescolate in DPBS in una siringa Hamilton sterile. Caricare la siringa sull'iniettore e distribuire un piccolo volume di soluzione su un drappo sterile monouso per innescare l'ago per l'iniezione. Utilizzare un applicatore a punta di cotone per pulire la siringa con il 70% di etanolo e allineare la punta dell'ago al centro della finestra calvariale fino a quando non tocca quasi il cerebro esposto.
Ripristinare la scala vernier digitale a zero e inserire lentamente l'ago in una profondità di tre millimetri nel cervello. Lasciare l'ago nel cervello per almeno 60 secondi prima di selezionare esegui sullo schermo dell'iniettore per iniziare la consegna delle cellule al sito di iniezione. Quando tutte le cellule sono state consegnate, lasciare riposare l'ago nel cervello per almeno tre minuti per consentire al parenchima cerebrale di acclimatarsi all'iniezione prima di ritrarre l'ago dal cervello ad una velocità di 0,75 millimetri al minuto.
Per la risonanza magnetica del carico tumorale, da 10 a 20 minuti prima dell'imaging nel momento sperimentale appropriato, somministrare 100 microlitri per 20 grammi di agenti di contrasto a base di gadolinio per il topo mediante iniezione intraperitoneale standard. Anestetizzare il mouse dopo l'iniezione e posizionare il mouse anestetizzato su un supporto riscaldato. Posizionare il supporto in un magnete da 9,4 T dotato di una bobina di superficie cerebrale del mouse e ottenere un'immagine localizzatore.
Quindi immagini il cervello del mouse usando una sequenza rara ponderata T2 e una sequenza rara ponderata T1 a contrasto post gadolinio. Per misurare il volume totale del tumore, aprire il file di dati mri di interesse in ImageJ e utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per disegnare un contorno intorno al tumore. Quindi aprire la scheda analizza e selezionare misura per ottenere l'area dell'area selezionata.
Quando tutto il tumore contenente fette per un singolo mouse in quel punto di tempo specifico è stato valutato, esportare i valori in un programma di analisi dei dati appropriato. Qui, è possibile osservare una panoramica rappresentativa della quantificazione del volume tumorale per un singolo topo al giorno 7 e al giorno 10 dopo l'iniezione di cellule tumorali mammarie murine. La valutazione di 30 fette per scansione ha rivelato che per questa analisi, al settimo giorno dopo l'iniezione, cinque fette mostravano un peso tumorale.
Mentre al giorno 10, nove fette mostravano un peso tumorale. L'area tumorale in ogni immagine è stata quindi misurata come dimostrato, consentendo di tracciare nel tempo il cambiamento del volume tumorale. Ogni linea cellulare e ogni modello di mouse destinatario è univoco e richiede pertanto l'ottimizzazione del numero di celle iniettate e della pianificazione della risonanza magnetica per garantire l'accuratezza dell'imaging.
Seguendo questa procedura, il cervello può essere raccolto essenzialmente per qualsiasi saggio a valle, incluso l'isolamento a singola cellula o l'analisi istopatologica.
