Questa procedura per la fusione e l'inserimento di finestre in silicone riduce le barriere tecniche all'imaging intravitale longitudinale. Il nostro protocollo produce finestre robuste, facilmente adattabili e ben tollerate dagli animali. Usando questa tecnica, abbiamo immaginato il cancro e le cellule immunitarie nel fegato, nel pancreas e nella ghiandola mammaria.
Con aggiustamenti minimi, potrebbe essere adattato a molte posizioni anatomiche e questioni biologiche. Per coloro che provano questa tecnica per la prima volta, esercitati a rilasciare piccole quantità di colla dalla siringa. L'applicazione di troppa colla offuscherà il campo di imaging e renderà difficile lavorare l'area chirurgica.
Inizia a fondere la finestra in silicone depositando una piccola quantità del polimero siliconico appena preparato, il polidimetilsilossano, di PDMS, su una superficie liscia e pulita e regola il rapporto volume/ area per ottenere lo spessore desiderato. Una volta depositato il PDMS sulla superficie di fusione desiderata, premere leggermente una griglia di acciaio inossidabile nel silicone per fornire punti di riferimento per l'imaging ripetuto delle stesse regioni tissutali. Per rimuovere le bolle d'aria e degassare il polimero siliconico, posizionare la superficie rivestita in un essiccatore sottovuoto per 45 minuti.
Al termine, polimerizzare il polimero in un forno a 75-80 gradi Celsius per 45 minuti. Segnare il polimero ai bordi dello stampo e utilizzare una pinza per staccare delicatamente le finestre indurite dalla superficie utilizzata per la fusione. Posizionare il mouse sulla posizione del decubito laterale sinistro.
Preparare il topo anestetizzato per la chirurgia applicando il 10% volume per volume di soluzione di iodio povidone e il 70% volume per volume di etanolo tre volte consecutivamente sul sito chirurgico rasato. Bisogna fare attenzione a mantenere un campo chirurgico sterile. Quindi, utilizzare forbici e pinze sterili per eseguire un'incisione di 10 millimetri sul fianco destro a tre millimetri sotto l'arco costale.
Rimuovere una sezione di un centimetro quadrato della pelle e utilizzare un secondo paio di forbici sterili e pinze per rimuovere una sezione del peritoneo leggermente più piccola della sezione della pelle. Depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico su una piastra di pozzo sterile e prelevarla con una siringa calibro 31 da applicare sulla superficie del fegato attorno ai bordi dell'area da fotografare, quindi posizionare la finestra sull'area desiderata e tenerla saldamente contro il fegato per circa due minuti fino a quando l'adesivo non si è asciugato. Dopo aver piegato i bordi della finestra sotto il peritoneo depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sui bordi della finestra che ora si trovano sotto il peritoneo, spingere verso il basso sul peritoneo con una pinza per fissarlo alla finestra.
Allo stesso modo, sigillare il peritoneo depositando una piccola quantità di adesivo chirurgico prima di spingere verso il basso la pelle, quindi applicare la colla attorno ai bordi della finestra per creare un bordo che impedisca alla pelle di ricrescere sopra la finestra. Per inserire la finestra nel pancreas, posizionare il mouse sulla posizione del decubito laterale destro e fare l'incisione sul fianco sinistro prima di rimuovere una sezione del peritoneo come dimostrato in precedenza. Usando tamponi di cotone sterili imbevuti di soluzione salina sterile, ha tirato delicatamente la milza per visualizzare il pancreas.
Riposizionare il pancreas con i tamponi di cotone inumiditi per rendere più visibile la superficie attraverso l'incisione. Una volta effettuato l'accesso al pancreas, inserire e sigillare la finestra di imaging sull'area desiderata come spiegato in precedenza. Per accedere alla ghiandola mammaria, posizionare il topo in posizione supina e fare un'incisione mediale di 10 millimetri a uno dei capezzoli inguinali usando forbici e pinze sterili.
Rimuovere una sezione di 0,5 centimetri quadrati della pelle sopra la ghiandola mammaria, quindi separare delicatamente la ghiandola mammaria dalla pelle diffondendo le forbici sterili tra le due superfici per interrompere l'aderenza. Utilizzare una siringa calibro 31 per applicare una piccola quantità di adesivo chirurgico sulla superficie della ghiandola mammaria intorno ai bordi dell'area da visualizzare. Posizionare e tenere saldamente la finestra contro la ghiandola mammaria fino a quando l'adesivo si asciuga.
Dopo aver piegato i bordi della finestra sotto la pelle, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sui bordi della finestra che ora sono sotto la pelle e spingere verso il basso sulla pelle con una pinza per fissare la pelle alla finestra. Applicare la colla attorno ai bordi della finestra per creare un bordo che impedisca alla pelle di ricrescere sopra la finestra. Prima di iniziare la sessione di imaging, pulire la finestra da eventuali detriti residui pulendola delicatamente con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70%.
Quando si utilizza una lente ad immersione in acqua, applicare il gel ad ultrasuoni alla finestra evitando bolle. Per avviare l'imaging, individuare e posizionare la griglia a fuoco attraverso gli oculari. Quindi determinare la profondità approssimativa dell'imaging tissutale impostando la parte inferiore della griglia su zero.
Le informazioni aiuteranno a localizzare il piano Z corrispondente nelle successive sessioni di imaging. Per identificare la stessa posizione in più sessioni di imaging, utilizzare i quadrati sulla griglia come punto di riferimento. Durante la sessione di imaging, annotare l'orientamento della griglia e la posizione di ciascun campo visivo ripreso all'interno della griglia.
La griglia può essere utilizzata per tornare a specifiche aree della griglia e campi di imaging nel successo delle sessioni di imaging. Dopo ogni sessione di imaging rimuovere eventuali residui di immersione della lente e detriti pulendo delicatamente la finestra con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70%. La finestra in silicone permette di catturare l'infiltrazione dinamica delle cellule immunitarie nel tempo.
L'analisi rappresentativa illustra l'infiltrazione dei neutrofili all'interno del tessuto mammario rimodellante ai giorni due e quattro. La finestra in silicone consente di visualizzare i tumori in più punti temporali per settimane dopo l'inserimento della finestra. Le finestre fuse con 200 milligrammi di PDMS sono generalmente migliori per l'impianto chirurgico in quanto hanno mostrato una tenacità significativamente maggiore rispetto alle finestre fuse con 150 milligrammi.
Da notare, le finestre PDMS non erano rigide come il vetro standard, rappresentato dal modulo di Young delle finestre di vetro significativamente maggiore del PDMS. L'inserimento della finestra in diversi organi è stato ben tollerato poiché la maggior parte dei topi ha continuato ad aumentare di peso nel tempo. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è sigillare completamente la finestra usando la colla.
Ciò impedisce l'infezione, l'essiccazione del tessuto e lo spostamento della finestra. Seguendo la procedura, le iniezioni ortotopiche possono essere eseguite attraverso la finestra di silicone, consentendo ai ricercatori di studiare un'ampia varietà di argomenti, come la proliferazione cellulare, le interazioni cellula-cellula e l'efficacia terapeutica.
