Questo protocollo consente di quantificare i livelli e la dinamica della metilazione dell'arginina. Questa modifica svolge importanti ruoli regolatori e potrebbe servire come biomarcatore per la malattia. Il vantaggio di questo metodo è che fornisce un flusso di lavoro semplice per un numero quasi illimitato di matrici che vanno da cellule, media, tessuti e biofluidi.
La metilazione dell'arginina è elevata in molti tumori umani e i primi inibitori delle transferasi del metodo dell'arginina sono testati in studi clinici. Questo metodo potrebbe aiutare con la stratificazione dei pazienti e la valutazione del rischio. A dimostrare la procedura sarà Hansjorg Habisch, un tecnico di ricerca del mio laboratorio.
Per i campioni liquidi, aggiungere 400 microlitri di metanolo ghiacciato a 200 microlitri del campione seguito da incubazione per 30 minuti a meno 20 gradi Celsius. Centrifugare questo campione a 10.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Spostare il surnatante e raccogliere il pellet in tubi da 1,5 millilitri.
Per i materiali solidi, aggiungere 600 microlitri di acqua al 66% di metanolo in tubi di polpa contenenti da 30 a 60 milligrammi di pellet di tessuto o celle. Omogeneizzare il tessuto molle una volta per 20 secondi e il tessuto rigido due volte per 20 secondi con un intervallo di cinque minuti in mezzo. Posizionare immediatamente il campione sul ghiaccio e trasferire tutto il lisato in un nuovo tubo da 1,5 millilitri, seguito dall'incubazione.
Quindi, centrifugare il campione a 10.000 G per 30 minuti. A quattro gradi Celsius, selezionare il surnatante in provette da 1,5 millilitri e procedere con l'idrolisi proteica utilizzando questo surnatante. Troncare i tappi di ciascun tubo.
Quindi aggiungere 500 microlitri di acido cloridrico a nove molari a ciascun campione. Infine, metti i tubi in tubi di vetro. Chiuderli saldamente con i tappi, assicurandosi una corretta tenuta, e posizionare questi tubi in un becher di vetro parzialmente riempito di sabbia.
Idrolizzare i campioni per 16 ore a 110 gradi Celsius in una camera di essiccazione. Raffreddare i campioni e liofilizzarli durante la notte utilizzando una centrifuga ad alto vuoto. Il giorno successivo, sciogliere i pellet completamente essiccati in un millilitro di acido cloridrico 0,1 molare.
Aggiungere 50 microlitri di cloroformio a ciascun tubo e sciogliere completamente il pellet utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri. Trasferire l'intero volume in una nuova provetta e centrifugare i campioni per 10 minuti. Raccogliere con cura la fase superiore del liquido bifasico in un nuovo tubo.
Utilizzare tubi di plastica per tubi manuali o tubi di vetro per l'estrazione robotizzata in fase solida. Per l'estrazione manuale in fase solida, precondizionare le cartucce in ogni ciclo seguito da una centrifugazione di un minuto. Successivamente, caricare il campione sulle cartucce SPE e centrifugarle a 600 G per due minuti a temperatura ambiente.
Lavare le cartucce con un millilitro di acqua tre volte, ogni lavaggio seguito da centrifugazione per un minuto. Quindi lavare cinque volte con un millilitro di acido cloridrico molare 0,1, seguito da centrifugazione per un minuto a 800 G a temperatura ambiente. Lavare le cartucce due volte con un millilitro di metanolo seguito da centrifugazione per un minuto.
Eluire l'arginina e i suoi derivati in un singolo tubo da 15 millilitri aggiungendo un millilitro di tre soluzioni sostitutive X e centrifugare due volte per un minuto. Per l'estrazione robotizzata in fase solida, posizionare i tubi per la raccolta degli eluati e i tubi di vetro contenenti la fase superiore del liquido bifasico nella rispettiva posizione del robot. Utilizzare un'applicazione o un metodo nel software in base ai passaggi descritti per SPE manuale.
Liofilizzare i campioni durante la notte per asciugare completamente per eliminare l'ammoniaca e l'acqua. Sciogliere ogni campione in 500 microlitri di tampone NMR fino a quando non diventa omogeneo. Quindi trasferire una quantità uguale di campione omogeneo a ciascuna provetta NMR.
Gli spettri J-RES degli idrolizzati proteici di lievito purificati utilizzando il protocollo SPE sono mostrati qui. Diversi cambiamenti chimici caratteristici possono discriminare L-arginina e ADMA a 3,25 e 3,02 parti per milione. Entrambe le sostanze possono essere separate e quantificate in una matrice cellulare.
Sulla base del numero di protoni del gruppo metilico o metilene specifico al rispettivo spostamento chimico, una spettroscopia di risonanza magnetica nucleare H consente una quantificazione precisa. Utilizzando questo approccio, gli spostamenti chimici di risonanza magnetica nucleare H di SDMA e MMA possono essere separati e quantificati da spostamenti chimici caratteristici a 2,76 parti per milione di SDMA e 2,74 parti per milione di MMA. Quando si esegue questo protocollo, raccogliere con cura la fase superiore del liquido bifasico contenente la frazione solubile in acqua con una pipetta e trasferirla in nuovi provette.
Utilizzare tubi da 1,5 millilitri per SPE manuale o vetro di classe per SPE robotizzati. Evitare di versare sul cloroformio e sul suo contenuto. Gli eluati contenenti arginina e le specie di arginina metilata vengono analizzati mediante spettroscopia NMR.
Questo produce quantità assolute di queste specie. La nostra tecnologia è attualmente utilizzata in una pletora di progetti di ricerca di base volti a sezionare il ruolo fisiopatologico della metilazione dell'arginina. Inoltre, stiamo valutando la metilazione dell'arginina proteica come candidato biomarcatore in diverse malattie umane.
