Questa ricerca è stata supportata dal fondo di avviamento VCU (a Y.G.) e dal National Institute Of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di premio R01GM132329 (a Y.G.) Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità. Ringraziamo Montserrat Samso e Kevin McRoberts per il loro generoso supporto per la registrazione video.

1. Espressione proteica
<ol><li>Inoculare 15 ml di supporti di brodo terrificante (TB) con antibiotici specifici per i plasmidi con cellule pLysS BL21(DE3) contenenti l'AcrB che esprime plasmidi in tubi da 50 ml durante la notte a 37 °C con scuotimento a 250 giri/min.</li>
	<li>Controllare la densità ottica della coltura notturna a 600 nm (OD600) e assicurarsi che sia superiore a 2,0.</li>
	<li>Diluire 5 mL di coltura cellulare in 1 L di mezzi tb contenenti antibiotici specifici per i plasmidi e incubare a 37 °C con scuotimento fino a OD600=0,8 e quindi indurre con IPTG che ha una concentrazione finale di 1 mM.</li>
	<li>Effettuare l'induzione a 20 °C con scuotimento per 20 ore.</li>
	<li>Pellet giù per le cellule utilizzando centrifugazione per 15 min a 4 °C e 4.000 x g.</li>
</ol>2.Lisi cellulare e isolamento della membrana
<ol><li>Resuspend il pellet di cellule nel tampone A(tabella 1, utilizzare DDM Buffer A o NCMNs Buffer A a seconda dello schema di purificazione che deve seguire) utilizzando 80 mL per ogni 20 g del pellet cellulare.</li>
	<li>Omogeneizzare i pellet cellulari rimescolati utilizzando un omogeneizzatore Dounce in vetro a 4 °C o se a temperatura ambiente assicurarsi di mettere sul ghiaccio subito dopo.</li>
	<li>Trasferire il campione in un becher metallico sul ghiaccio e liscire le cellule caricandole in un omogeneizzatore ad alta pressione a 4 °C e 1.500 bar.<ol>
<li>Ripetere il processo di caricamento delle cellule nell'omogeneizzatore e consentire loro di passare attraverso l'omogeneizzatore per 3-4 cicli o fino a quando il lisato inizia a chiarire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugare il lysate a 15.000 x g per 30 min a 4 °C.</li>
	<li>Raccogliere il supernatante e caricarlo in tubi ultracentrifugo e centrifuga a 215.000 x g per 1 h a 4 °C.</li>
	<li>Scartare il supernatante e raccogliere i pellet di membrana dai tubi ultracentrifugo. Conservare il pellet di membrana in eccesso a -80 °C.</li>
</ol>3. Preparazione di nanoparticelle di membrana cellulare nativa
<ol><li>Resuspend 1 g di pellet di membrana in 10 mL NCMN Buffer A(Tabella 1).</li>
	<li>Omogeneizzare il campione di membrana cellulare rimorsied con un omogeneizzatore Dounce in vetro a 20 °C.</li>
	<li>Trasferire il campione di membrana sospesa in un tubo di polipropilene da 50 ml e aggiungere la soluzione di stock di polimeri attivi a membrana e il buffer A NCMN aggiuntivo per portare il campione a una concentrazione finale del polimero attivo a membrana 2,5% (w/v) (NCMNP1-1 o NCMNP5-2). NOTA: Le soluzioni stock di polimeri attivi a membrana devono essere realizzate in acqua distillata doppia e possono essere mantenute a concentrazioni variabili, ma in genere al 10% (w/v).</li>
	<li>Agitare il campione per 2 ore a 20 °C.</li>
	<li>Caricare il campione in un ultracentrifugo e girare a 150.000 x g per 1 h a 20 °C.</li>
	<li>Mentre il campione è ultra-centrifugato iniziano ad equilibrare una colonna Ni-NTA da 5 mL con 25 mL di NCMN Buffer A.</li>
	<li>Raccogliere il supernatante al termine dell'ultracentrifugazione e caricarlo su 5 ml di colonna Ni-NTA a temperatura ambiente con una portata di 0,5 ml/min utilizzando una pompa per siringhe.</li>
	<li>Lavare le linee di cromatografia liquida proteica veloce (FPLC) con un numero sufficiente di NCMN Buffer B (Tabella 1) per sciacquare completamente il sistema e quindi collegare la colonna alla macchina FPLC.</li>
	<li>Lavare la colonna con 30 mL di NCMN Buffer B con una portata di 1 mL/min e raccogliere il flusso attraverso.</li>
	<li>Lavare la colonna con 30 mL di NCMN Buffer C (Tabella 1) con una portata di 1 mL/min e raccogliere il flusso.</li>
	<li>Elute la proteina con 20 mL di NCMNs Buffer D (Tabella 1) ad una portata di 0,5 mL/min e raccogliere il campione utilizzando un raccoglitore di frazioni e le frazioni ciascuna impostate su 1,0 mL.</li>
	<li>Conservare i campioni proteici a 4 °C.</li>
	<li>Eseguire un test di elettroforesi del gel SDS-PAGE per controllare i campioni che corrispondono ai picchi osservati sul grafico di eluizione FPLC.</li>
</ol>4. Elettroforesi gel SDS-PAGE
<ol><li>Preparare la camera di colata bloccando il vetro all'apparecchio di colata.</li>
	<li>Preparare il gel di separazione del 12% secondo la ricetta elencata nella tabella 1. NOTA: Una volta aggiunto TEMED, il gel si polimerizzerà rapidamente, quindi aggiungi questo solo una volta pronto per versare il gel.</li>
	<li>Versare il gel, lasciando 2 cm sotto il fondo del pettine per il gel impilamento.</li>
	<li>Rimuovere eventuali bolle stratificando la parte superiore del gel con isopropanolo al 100% e attendere che il gel di separazione polimerizzi.</li>
	<li>Rimuovere l'isopropanolo e lavare eventuali tracce dell'isopropanolo con acqua distillata.</li>
	<li>Preparare il gel impilamento secondo la ricetta elencata nella tabella 1. NOTA: Una volta aggiunto TEMED, il gel si polimerizzerà rapidamente, quindi aggiungi questo solo una volta pronto per versare il gel.</li>
	<li>Versare il gel impilamento sopra il gel di separazione.</li>
	<li>Aggiungere un pettine alla camera per formare i pozzi e attendere che il gel impilamento polimerizzi completamente.</li>
	<li>Posizionare 1 μL di 1 M DTT in un tubo di microcentrifugo per ogni campione di frazione che deve essere eseguito sul gel.</li>
	<li>Aggiungere anche 7 μL di tampone di carico 4x a ciascun tubo.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL di campione dalle frazioni che devono essere eseguite sul gel a ciascun tubo di microcentrifugo.</li>
	<li>Vortice i tubi contenenti i campioni.</li>
	<li>Ruotare i tubi campione utilizzando un microcentrifugo da tavolo per 3 s e assicurarsi che tutto il campione sia tornato sul fondo dei tubi.</li>
	<li>Preparare la cella di elettroforesi in gel fissando una cassetta in gel di poliacrilammide al 12% in posizione e riempiendo le camere interne ed esterne della cella con tampone Tris-acetato-EDTA (TAE)(tabella 1).</li>
	<li>Caricare il marcatore di peso molecolare nella prima corsia del gel con il volume appropriato richiesto dalle sue istruzioni.</li>
	<li>Caricare 28 μL del campione da ciascun tubo miscelato con DTT e tampone di carico.</li>
	<li>Posizionare il coperchio della cella di elettroforesi sopra la scatola e collegare il coperchio all'alimentatore.</li>
	<li>Accendere l'alimentatore e impostarlo su 100 V e consentirgli di funzionare per 20 minuti.</li>
	<li>Dopo 20 minuti, aumentare la corrente di alimentazione a 140 V e continuare a eseguirla per altri 30-40 minuti o fino a quando la banda di carico del colorante tampone raggiunge il fondo della cassetta di gel.</li>
	<li>Dopo aver completato la macchia di elettroforesi e de-macchiare il gel per visualizzare le bande proteiche contenute all'interno del gel.</li>
</ol>5. Purificazione delle proteine con DDM
NOTA: Lo scopo di eseguire questo processo di purificazione è quello di servire da controllo per gli esperimenti che utilizzano i polimeri attivi a membrana.
<ol><li>Resuspend 6-10 g di pellet di membrana, dal passaggio 2.6, in DDM Buffer A(Tabella 1)utilizzando 5 mL/g di pellet di membrana.</li>
	<li>Omogeneizzare il campione rimescolato con un omogeneizzatore Dounce in vetro a 4 °C o se a temperatura ambiente assicurarsi di mettere sul ghiaccio subito dopo.</li>
	<li>Trasferire il campione in un tubo di polipropilene da 50 ml e aggiungere DDM e tampone DDM A aggiuntivo per portare il campione a una concentrazione finale del 2% di DDM.</li>
	<li>Agitare il campione per 2 ore a 4 °C.</li>
	<li>Caricare il campione in tubi ultracentrifugo e centrifuga per 1 h a 4 °C e 150.000 x g.</li>
	<li>Mentre il campione viene ultra-centrifugato, iniziare a preparare i 5 mL della colonna Ni-NTA lavandosi con 25 mL di tampone DDM A(tabella 1).</li>
	<li>Al termine dell'ultracentrifugazione, raccogliere il supernatante e caricarlo sulla colonna Ni-NTA da 5 ml a 4 °C con una portata di 0,5 mL/min utilizzando una pompa per siringhe.</li>
	<li>Lavare le linee FPLC con un DDM Buffer B + 0,05% DDM sufficiente (Tabella 1) per svuotare completamente il sistema e quindi collegare la colonna alla macchina FPLC.</li>
	<li>Lavare la colonna con 30 mL di DDM Buffer B + 0,05% DDM con una portata di 1 mL/min e raccogliere il flusso attraverso.</li>
	<li>Lavare la colonna con 30 mL di DDM Buffer C + 0,05% DDM (Tabella 1) con una portata di 1 mL/min e raccogliere il flusso.</li>
	<li>Elute la proteina con 20 mL di DDM Buffer D + 0,05% DDM (Tabella 1) ad una portata di 0,5 mL/min e raccogliere il flusso utilizzando un raccoglitore di frazioni e le frazioni ciascuna impostate su 1,0 mL.</li>
	<li>Selezionare le frazioni contenenti il picco di eluizione per la messa in comune e la concentrazione utilizzando un concentratore centrifugo e centrifugando a 4.000 x g e 4 °C fino a raggiungere i 500 μL.</li>
	<li>Utilizzando un loop da 500 μL caricare il campione nella macchina FPLC e quindi sulla colonna di esclusione delle dimensioni di 25 mL a 4 °C. Elute utilizzando 30 mL di DDM Buffer E + 0,05% DDM (Tabella 1) ad una portata di 0,5 mL/min e raccogliere come frazioni con le dimensioni delle frazioni impostate su 0,5 mL per frazione.</li>
	<li>Prendi le frazioni e misura la concentrazione proteica usando l'assorbanza di 280 nm per confermare la curva UV-Vis dal grafico di eluizione FPLC.</li>
	<li>Raccogliere 20 μL da ogni frazione campione che corrispondono ai picchi osservati sul grafico di eluizione FPLC e sono stati confermati accurati con il test di assorbanza.</li>
	<li>Congelare il resto di tali frazioni di campione utilizzando azoto liquido o ghiaccio secco nelle aliquote desiderate e conservare campioni proteici a -80 °C.</li>
	<li>Eseguire un test di elettroforesi del gel SDS-PAGE come descritto in precedenza per controllare i campioni che corrispondono ai picchi osservati sul grafico di eluizione FPLC.</li>
</ol>6. Preparazione negativa della griglia di macchie
<ol><li>Posizionare le griglie che verranno utilizzate per la preparazione del campione su uno scivolo di vetro avvolto in carta da filtro con il lato in carbonio rivolto verso l'alto.</li>
	<li>Posizionare lo scivolo di vetro con le griglie del microscopio elettronico nella camera di uno scaricatore di bagliore tra i due elettrodi e sostituire il coperchio di vetro assicurandosi che sia centrato e ben sigillato.</li>
	<li>Eseguire la macchina di scarico del bagliore e assicurarsi che la luce viola generata dal plasma sia visibile.</li>
	<li>Al termine della macchina, attendere che la camera abbia raggiunto la pressione atmosferica per rimuovere il coperchio di vetro e quindi riportare lo scivolo con le griglie sul banco dove verranno caricati i campioni su di essi.</li>
	<li>Regolare la concentrazione dei campioni di proteine purificate a circa 0,1 mg/mL diluendo il campione con il tampone appropriato o concentrandosi utilizzando un concentratore centrifugo.</li>
	<li>Caricare 3,5 μL di campione proteico sulla griglia di carbonio spessa 10 nm e attendere 1 minuto.</li>
	<li>Rimuovere il liquido dalla superficie della griglia EM con una carta da filtro.</li>
	<li>Lavare la superficie della griglia 3 volte captando 3 μL di goccioline d'acqua con la griglia e rimuovendo l'acqua dalla griglia con carta da filtro tra il prelievo di ogni goccia.</li>
	<li>Lavare la superficie della griglia 2 volte raccogliendo 3 goccioline di acetato di uranio fresco filtrato al 2% e rimuovere le soluzioni di lavaggio sulla griglia con carta da filtro tra il prelievo di ogni goccia.</li>
	<li>Macchiare la griglia con una goccia da 3 μL di acetato di uranio fresco filtrato al 2% per 1 min.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di acetato di uranio sulla superficie della griglia EM con carta da filtro e asciugare ad aria la griglia per almeno 1 minuto.</li>
	<li>Archiviare la griglia in una casella della griglia per l'uso successivo.</li>
</ol>7. Imaging EM
<ol><li>Caricare la griglia preparata nel supporto della griglia in un workbench sicuro.</li>
	<li>Preparare il microscopio posizionando i microscopi dewar in una scatola di polistirolo e riempire il dewar 3/4° pieno di azoto liquido.</li>
	<li>Verificare che il coperchio in gomma della finestra del microscopio lo copra e quindi caricare il dewar al microscopio posizionando i fili di rame nel dewar fino a quando non si adatta alla piattaforma.</li>
	<li>Riempire il resto del dewar con azoto liquido e posizionare un tappo sopra il dewar per coprirlo.</li>
	<li>Accendi l'alta tensione, condiziona il microscopio e attendi che il microscopio si il riscaldamento e stabilisca un livello di vuoto sicuro per l'uso.</li>
	<li>Una volta che il microscopio è pronto aprire la valvola a colonna e confermare che il fascio è presente rimuovendo il coperchio di gomma sulla finestra del microscopio.</li>
	<li>Controllare la stigmatizzazione del fascio diffondendosi in uscita regolando l'intensità del fascio. Se l'astigmatismo è presente, la trave avrà una forma ellittica mentre ci si allontana dalla traversa e la trave dovrebbe avere la stessa forma ovale su entrambi i lati.</li>
	<li>Regolare il binocolo del microscopio in modo che sia la giusta altezza e distanza secondo gli occhi dell'osservatore.</li>
	<li>Controllare il posizionamento del fascio per le modalitàRicerca , Messaa fuoco ed Esposizione pedalando in tutte e tre le modalità fino a quando la trave non è al centro in ciascuna di essi.</li>
	<li>Chiudere la valvola a colonna e procedere al caricamento del supporto della griglia nel microscopio elettronico.</li>
	<li>Regolare il microscopio in altezza eucentrica utilizzando la funzione wobbler dei microscopi e regolando il movimento dello stadio utilizzando l'asse Z fino a quando non vi è alcun movimento laterale del campione al centro.</li>
	<li>Utilizzando la modalità di ricerca a bassa dose al microscopio cercare nella griglia un'area desiderabile di ragionevole contrasto con le molecole campione presenti per concentrarsi sul campione.</li>
	<li>Concentrati sull'esempio in modalità Messa a fuoco usando una dimensione del passaggio elevata fino a quando il campione non viene visto e quindi riduci i passaggi per trovare il livello di messa a fuoco corretto.</li>
	<li>Azzerare e spegnere il fascio e quindi assicurarsi che il cuscinetto di gomma copra la finestra del microscopio.</li>
	<li>Utilizzando la modalità Esposizione prendere l'immagine dell'area della griglia desiderata per un'esposizione di 1 s a 62.000 volte l'ingrandimento e controllare l'immagine ottenuta.</li>
	<li>Al termine dell'imaging di una griglia, chiudere le valvole della colonna e rimuovere il supporto della griglia dalla colonna.</li>
	<li>Al termine dell'imaging, tutte le reti di interesse arrestano il microscopio spegnendo la potenza del filamento e rimuovendo il dewar dell'azoto liquido dal microscopio.</li>
	<li>Posizionare qualcosa per assorbire l'umidità sul supporto dove il dewar sedeva per catturare la condensa dalle bobine di rame del microscopio.</li>
	<li>Attivare la modalità Cryo Cycle e assicurarsi che la pompa turbo sia spenta.</li>
</ol>

<ol>
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(132), e57199 (2018).</li><li>Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+of+AcrB+Subunit+Precedes+Trimerization.">Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization.</a> Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).</li><li>Lebon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and Function of GPCRs. , 229-230 (2019).</li><li>Rames, M., Yu, Y., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+negative+staining:+a+high-throughput+protocol+for+examining+small+and+asymmetric+protein+structure+by+electron+microscopy.">Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).</li><li>Lee, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+detergent-free+isolation+of+membrane+proteins+in+their+local+lipid+environment.">A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).</li><li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles.">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li><li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene/Maleic+Acid+Copolymer.">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li></ol>

Y.G è elencato come inventore del polimero attivo a membrana NCMNP5-2 e sistema NCMN.

Le interazioni proteina-proteina sono importanti per l'integrità della struttura e della funzione delle proteine di membrana. Sono stati sviluppati molti approcci per studiare le interazioni proteina-proteina. Rispetto alle proteine solubili, le proteine di membrana e i loro IPP sono più difficili da studiare a causa delle proprietà intrinseche uniche delle proteine di membrana. Questa difficoltà deriva principalmente dal requisito che le proteine di membrana siano incorporate in un ambiente bistrato lipidico nativo ...

Le interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale in tutta la biologia, dal mantenimento della struttura e della funzione delle proteine alla regolazione di interi sistemi. Gli IPP sono disponibili in molte forme diverse e possono essere classificati in base ai tipi di interazioni che formano. Una di queste categorizzazioni è omooligomerica o eterooligomerica, basata sul fatto che le interazioni siano tra subunità identiche o proteine diverse che agiscono come subunità. Un'altra categorizzazione si basa sulla forza dell'interazione se le interazioni portano alla formazione di complessi stabili o stati complessi transitori. Le informazioni strutturali sugli IPP tra le proteine sono cruciali per comprendere il meccanismo con cui le proteine svolgono la loro funzione. È stato stimato che oltre l'80% delle proteine si basa su una formazione complessa al fine di svolgere i loro ruoli funzionali1. Data la percentuale di proteine osservate che dipendono dagli IPP per un corretto funzionamento innato, il loro significato in biologia è facilmente evidente, ma essere in grado di indagare correttamente le proteine che si impegnano in queste interazioni è rimasto impegnativo a causa dei limiti nelle tecniche disponibili per osservare sperimentalmente quando le proteine formano IPP.
C'è un alto grado di disaccordo tra i risultati per molti IPP determinati sperimentalmente a causa dell'elevata quantità di rumore, falsi positivi e falsi negativi che derivano da molte delle tecniche di determinazione PPI attualmente disponibili. Ciò è particolarmente vero per il sistema bi-ibrido di lievito (Y2H), la spettrometria di purificazione di purificazione tandem-massa (TAP-MS) e il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET), che rappresentano tre dei metodi più comunemente utilizzati per la determinazione PPI2,3,4,5,6,7. In confronto, le tecniche di biologia strutturale delle proteine, come la risonanza magnetica nucleare (NMR), la cristallografia a raggi X e la microscopia elettronica (EM), possono essere utilizzate per ottenere informazioni strutturali ad alta risoluzione sulle interazioni proteina-proteina fino al livello atomico e consentire la conferma visiva diretta delle interazioni che si verificano per una proteina bersaglio di interesse. Tutte le tecniche di ricerca di determinazione PPI non basate sulla struttura attualmente disponibili (ad esempio, Y2H, TAP-MS e FRET) mancano di questa capacità e soffrono inoltre di difficoltà nell'identificare interazioni deboli e transitorie tra proteine5. Queste carenze sono ulteriormente migliorate quando si studiano le proteine di membrana a causa della complessità aggiunta portata dalla variabile aggiuntiva dell'ambiente lipidico che influenza la formazione di una corretta struttura quaternaria e assemblaggio complesso eteromerico.
Le proteine di membrana covano gran parte del proteoma e sono note per svolgere molti ruoli cruciali nel corretto funzionamento cellulare all'interno di tutti gli organismi viventi. Nonostante si stima che le proteine di membrana costituiscano il 27% del genoma umano e costituiscano ~ 60% di tutti gli attuali obiettivifarmacologici,c'è una grande anomalia nel numero di modelli risolti per le proteine di membrana che costituiscono solo ~ 2,2% di tutte le strutture proteichepubblicate 8,9,10. La causa principale della discrepanza nella disponibilità di informazioni strutturali risiede nelle proprietà intrinseche delle proteine di membrana stesse. A causa della loro scarsa solubilità, della dipendenza dalle interazioni con un ambiente lipidico per mantenere la struttura e la funzione nativa e di varie proprietà fisicochimiche della membrana lipidica stessa, le proteine di membrana continuano a rappresentare un problema sostanziale quando implementano tecniche di biologia strutturale per studiarle. Di queste proprietà intrinseche, la più importante per ottenere informazioni strutturali accurate è il requisito di avere interazioni con il loro ambiente lipidico naturale per mantenere la loro struttura e funzione nativa. L'ambiente lipidico è parte integrante della struttura e della funzione delle proteine di membrana che il concetto di memteina (una combinazione delle parole membrana e proteina) è stato proposto come unità fondamentale della struttura membrana-proteina e dellafunzione 11. Nonostante l'importanza delle interazioni lipidico-proteina, le tecniche di determinazione PPI attualmente disponibili a base di struttura spesso richiedono che le proteine studiate siano solubili o solubilizzate con detergenti. L'esposizione a detergenti aggressivi può denaturare le proteine o causare falsi positivi e negativi a causa della delipidazione, che può indurre aggregazione, denaturazione delle proteine, dissociazione di interazioni non covalenti e formazione di stati oligomerici artificiali. A causa della necessità di mantenere un ambiente lipidico naturale per una determinazione accurata dello stato oligomerico nativo delle proteine di membrana abbiamo sviluppato un sistema di nanoparticelle di membrana a cellule native (NCMN)12 basato sul metodo Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 precedentemente riportato.
SMALP utilizza il copolimero dell'acido maleico stirene come polimero attivo di membrana per estrarre e solubilizzare le proteine della membrana. Il poli(acido stirene-co-maleico) (SMA) è un polimero anfifilo unico per la sua moietà di stirene idrofobica e la moietà dell'acido maleico idrofilo diametralmente opposta. Forma nanoparticelle adsorbendo, destabilizzando e interrompendo la membrana cellulare in un meccanismo dipendente dal pH14. Questa attività funzionale di SMA è ciò che consente di utilizzarla come sistema privo di detergenti per l'estrazione e la solubilizzazione delle proteine di membrana. Il sistema NCMN è distinto dal sistema SMALP sotto diversi aspetti. La caratteristica più unica del sistema NCMN è che ha una libreria di polimeri attivi a membrana con una moltitudine di polimeri che hanno proprietà uniche che li rendono adatti all'isolamento di molte diverse proteine di membrana che richiedono condizioni diverse per la stabilità e il funzionamento nativo. Il sistema NCMN ha anche protocolli diversi rispetto al metodo SMALP quando si tratta di preparare le nanoparticelle. Uno di questi esempi è che gli NCMN utilizzano una purificazione della colonna di affinità al nichel a passo singolo per la determinazione della struttura ad alta risoluzione; l'effetto di questi diversi protocolli può essere osservato quando si confronta il protocollo NCMN, che ha generato strutture crio-EM AcrB 3.2 e 3.0 Å, con uno studio simile utilizzando il metodo SMALP, che ha portato a una struttura crio-EM AcrB con una risoluzione 8.8 Å12,15. Queste caratteristiche uniche del sistema NCMN sono i miglioramenti apportati al metodo SMALP precedentemente stabilito e lo rendono un candidato ideale per lo studio degli IPP.
Il trasportatore multifarmaco Efflux AcrB esiste come omotrimero funzionale in E. coli12. Un'analisi mutagena ha suggerito che una singola mutazione puntino P223G, situata su un circuito responsabile della stabilità del trimer AcrB, destabilizza lo stato del trimer e produce un monomero AcrB quando preparato con il detergente DDM, che potrebbe essere rilevato con elettroforesi del gel blu nativo16. Tuttavia, l'analisi FRET del mutante AcrB-P223G suggerì che quando nell'ambiente bistrato lipidico della membrana cellulare nativa, la maggior parte dell'AcrB-P223G mutante esisteva ancora come trimestre e che i livelli di espressione sia per il tipo selvaggio AcrB che per L'AcrB-P223G sono simili. Tuttavia, nonostante i risultati dell'analisi FRET, un test di attività per il trasportatore mutante ha mostrato che l'attività è diminuita drasticamente rispetto al tiposelvaggio 16. Sebbene la tecnologia FRET sia stata popolarmente utilizzata per l'analisi delle interazioni proteina-proteina, la ricerca ha dimostrato che può spesso dare falsi positivi17,18,19,20.
Recentemente, sono state determinate strutture crio-EM ad alta risoluzione del trimer AcrB che hanno mostrato l'interazione di AcrB con il suo bistrato lipidico a membrana cellulare nativa associata attraverso l'uso delle NCMN12. In linea di principio, gli NCMN possono essere facilmente utilizzati per l'analisi delle interazioni proteina-proteina trovate sulla membrana cellulare nativa. In un test di questo sistema, sono stati effettuati esperimenti per osservare direttamente lo stato oligomerico di AcrB-P223G con l'uso di nanoparticelle di membrana cellulare nativa e microscopia elettronica di colorazione negativa. Al fine di confrontare con le nanoparticelle AcrB di tipo selvatico, abbiamo utilizzato lo stesso polimero attivo a membrana (SMA2000 realizzato nel nostro laboratorio, che è indicizzato come NCMNP1-1 nella libreria NCMN) utilizzato per la determinazione della struttura crio-EM ad alta risoluzione di AcrB e polimeri alternativi trovati nella libreria NCMNs12. Sulla base dei risultati precedentemente riportati, ci si aspettava che la maggior parte del mutante AcrB-P223G esistesse sotto forma di nanoparticelle di membrana cellulare nativa trimerica21. Tuttavia, nel campione non sono stati trovati trimer AcrB, come quelli osservati con il tipo selvaggio AcrB. Ciò suggerisce che la maggior parte dell'AcrB-P223G non forma trimer sulla membrana cellulare nativa come suggerito in precedenza.
Qui riferiamo un'analisi dettagliata del mutante E. coli AcrB-P223G in confronto al tipo selvatico E. coli AcrB utilizzando le NCMN. Questo caso di studio dell'AcrB suggerisce che gli NCMN sono un buon sistema per l'analisi dell'interazione proteina-proteina.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A38S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-105-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (Dithiothreitol) (&#62; 99% pure) Protease free</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>DTT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17525 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AA3622636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylethylenediamine (EDTA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8.03779.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCMNS-P5-2</td>
			<td>Not commercially available yet</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA2000</td>
			<td>Cray Valley</td>
			<td>Submit request for obtaining to corresponding author</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>TCEP25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth Media</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75856 1 KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Ambinter</td>
			<td>Amb22348393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-26S XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Electron Microscope Grids (10 nm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>CF300-Cu-TH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Con-Torque Tissue Homogenizer</td>
			<td>Eberbach</td>
			<td>E7265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning LSE Mini Microcentrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-203-954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction Collector F9-R</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29003875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN LL-IM-12AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>91000S-230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>358013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecnai F20 200kV</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA pure 25 L1 FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3)pLysS Cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C606003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HisTrap HP 5 ml Column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17524802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-24a</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>69749-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

native cell membrane nanoparticles system for membrane protein-protein interaction analysis

Le interazioni proteina-proteina nei sistemi a membrana cellulare svolgono un ruolo cruciale in un'ampia gamma di processi biologici, dalle interazioni cellula-cellula alla trasduzione del segnale; dal rilevamento dei segnali ambientali alla risposta biologica; dalla regolazione metabolica al controllo dello sviluppo. Informazioni strutturali accurate sulle interazioni proteina-proteina sono cruciali per comprendere i meccanismi molecolari dei complessi proteici di membrana e per la progettazione di molecole altamente specifiche per modulare queste proteine. Sono stati sviluppati molti approcci in vivo e in vitro per il rilevamento e l'analisi delle interazioni proteina-proteina. Tra questi l'approccio della biologia strutturale è unico in quanto può fornire informazioni strutturali dirette sulle interazioni proteina-proteina a livello atomico. Tuttavia, l'attuale biologia strutturale delle proteine di membrana è ancora in gran parte limitata ai metodi a base di detergenti. Il principale svantaggio dei metodi a base di detergenti è che spesso dissociano o denaturano i complessi proteici della membrana una volta che il loro ambiente bistrato lipidico nativo viene rimosso dalle molecole di detergente. Abbiamo sviluppato un sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per la biologia strutturale delle proteine di membrana. Qui, dimostriamo l'uso di questo sistema nell'analisi delle interazioni proteina-proteina sulla membrana cellulare con un caso di studio dello stato oligomerico di AcrB.

Utilizzando le procedure qui presentate, sono stati purificati campioni di tipo selvatico E. coli AcrB e AcrB-P223G mutante E. coli. I campioni sono stati quindi adsorbiti alle griglie di microscopia elettronica a macchia negativa di carbonio e macchiati usando acetato di uranile con il metodo di soffiatura laterale22. Le immagini delle macchie negative sono state raccolte usando la microscopia elettronica a trasmissione. L'immagine di macchia negativa per il campione di tipo sel...

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Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Presentato qui è un protocollo per la determinazione dello stato oligomerico delle proteine di membrana che utilizza un sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa in combinazione con la microscopia elettronica.

Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

native-cell-membrane-nanoparticles-system-for-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

5.9K Views.  Virginia Commonwealth University. Presentato qui è un protocollo per la determinazione dello stato oligomerico delle proteine di membrana che utilizza un sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa in combinazione con la microscopia elettronica.

Video: Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Ricerca

Biochimica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

Un lievito modificato - un sistema ibrido per studi di interazione tra DNA e proteine ​​eteromeriche

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylated Cell-penetrating peptidi per studiare le interazioni proteina-proteina intracellulare

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

Una piattaforma di membrana modello per la ricostituzione delle dinamiche della membrana mitocondriale

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...