In questa particella, introduciamo una piattaforma di ricostituzione in vitro che imita l'ambiente lipidico della membrana interna dei mitocondri. Questa piattaforma può essere utilizzata per studiare i meccanismi molecolari della fusione della membrana interna dei mitocondri. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio quantitativo delle proteine integrali della membrana e delle proteine associate alla membrana in un ambiente quasi nativo.
Per iniziare, mescolare le soluzioni A e B in base alle indicazioni manoscritte, quindi generare la miscela lipidica aggiungendo il volume calcolato della soluzione di conservazione in fiale ambrate con una siringa di vetro. Abbina il volume finale aggiungendo cloroformio extra nelle fiale. Cuocere vetrini in vetroresina al microscopio a 520 gradi Celsius per 30 minuti.
Dopo la cottura, raffreddarli a temperatura ambiente. Aggiungere circa 10 grammi di idrossido di sodio a 500 millilitri di metanolo durante l'agitazione. Mescolare per due ore, continuando ad aggiungere idrossido di sodio alla soluzione fino a quando il precipitato inizia a mostrare.
Pulire i vetrini in soluzione di solfato di dodecil di sodio al 10%, metanolo saturo di idrossido di sodio e acido cloridrico millimolare, bagno sequenziale sonicando i vetrini in ogni condizione per 30 minuti. Pulire gli scivoli di vetro in acqua ultrapura per 10 minuti tra ogni condizione. Conservare il vetro di copertura pulito sigillato in soluzione di acido cloridrico per un massimo di due settimane per garantire una buona qualità bistrato.
Pulire il trogolo di politetrafluoroetilene del sistema di immersione Langmuir-Blodgett utilizzando acqua cloroformio e ultrapura fino a quando non si osserva no bagnature. Spruzzare il cloroformio sulla superficie del trogolo e pulirlo accuratamente tre volte con salviette di cellulosa, quindi sciacquarlo tre volte con acqua ultrapura e rimuovere l'acqua tramite aspirazione. Al termine, coprire la superficie del trogolo con acqua ultrapura pulita.
Prendere due pezzi di coverglass trattati in superficie dalla soluzione detergente e risciacquarli con acqua ultrapura per circa 30 secondi. Posizionare il vetro di copertura in modo back-to-back utilizzando il morsetto del substrato per tenere i vetrini. Immergere lo scivolo di vetro sotto la superficie dell'acqua facendo clic manualmente sul dipper verso il basso sul sistema di controllo Langmuir.
Azzerare il bilanciamento del film e diffondere con cura la soluzione B goccia a goccia sull'interfaccia dell'acqua dell'aria. Assicurarsi che i lipidi si diffondano solo all'interfaccia dell'acqua dell'aria senza goccioline cloroformio e lipidiche che affondano sul fondo della superficie del politetrafluoroetilene, che creerà un canale lipidico e impedirà la formazione del monostrato. Interrompere l'aggiunta di lipidi quando la lettura del bilanciamento del film è di circa 15-20 millinewton al metro.
Attendere da 10 a 15 minuti, quindi avviare il controller di barriera per modificare l'area della superficie facendo clic su Avvia esperimento. Attendere che la lettura della bilancia del film aumenti a 37 millinewton al metro e mantenere la pressione per circa 20-30 minuti. Sollevare il vetro di copertura alla velocità di 22 millimetri al minuto mantenendo la tensione superficiale a 37 millinewton per metro.
Un monostrato lipidico con tethering polimerico verrà trasferito dall'interfaccia dell'acqua dell'aria alla superficie del vetro di copertura attraverso il processo di immersione Blodgett, formando il foglio illustrativo inferiore del bistrato lipidico. Pulire l'interfaccia dell'acqua dell'aria aspirazione e sciacquare il trogolo con acqua ultrapura. Dopo aver pulito uno scivolo di vetro con un pozzo con cloroformio, etanolo e acqua ultrapura, impostarlo sul trogolo sotto lo strato d'acqua.
Assicurarsi che il pozzo sia rivolto verso l'interfaccia dell'acqua dell'aria e versare acqua fresca ultrapura fino a quando lo scivolo di vetro è completamente coperto, quindi immergere lo scivolo di vetro sotto la superficie dell'acqua come descritto in precedenza. Tenere il coverglass con il monostrato lipidico utilizzando una ventosa in silicio e spingere delicatamente il monostrato lipidico nell'interfaccia dell'acqua dell'aria. Tenere il vetro di copertura per due o tre secondi sull'interfaccia, quindi spingerlo contro la diapositiva.
Togliere lo scivolo con il vetro di copertura. Porta il coverglass e il bisstrato al microscopio a epifluorescenza e immagini il bistrato lipidico secondo le indicazioni del manoscritto testuale. Preparare una piastra di cristallizzazione contenente acqua ultrapura e posizionare un anello di immagine al microscopio pulito sotto il piatto.
Immergere questo scivolo e coverglass che contengono il bistrato lipidico sotto l'acqua. Separare delicatamente lo scivolo e il coverglass, tenendo premuto lo scivolo in vetroresina dal basso e trasferire il vetro di copertina nell'anello dell'immagine. Sostituire l'acqua ultrapura nell'anello dell'immagine con tampone di cloruro di sodio bis-tris, assicurandosi che il bistrato lipidico non sia esposto ad alcuna bolla d'aria.
Aggiungere 1,1 nanomolare n-ottil-beta-glucopyranoside al bistrato lipidico, quindi aggiungere immediatamente la miscela di 1,2 DDM nanomolare e 1,3 picomoli di L-OPA1 purificato nell'anello dell'immagine. Incubare il campione su uno shaker da banco a bassa velocità per due ore. Distribuire perline di resina SM-2 da 30 milligrammi in tre millilitri di tampone bis-tris e agitare.
Utilizzare una pipetta di plastica per aggiungere da 5 a 10 microlitri delle perline di resina SM-2 all'anello dell'immagine e incubarla per 10 minuti, quindi risciacquare le perline di resina. Il volume finale del buffer nell'anello dell'immagine dovrebbe essere di 1,5 millilitri. Preparare un milligrammo di miscela lipidica A in soluzione cloroformio, quindi evaporare il cloroformio sotto flusso di azoto per 20 minuti.
Mantenere la miscela sotto vuoto durante la notte per formare un film lipidico. Preparare 50 millimolari di calcio contenenti tampone sciogliendo 15,56 grammi di calceina in 50 millilitri di soluzione di idrossido di sodio molare 1,5. Mescolare la miscela a temperatura ambiente fino a quando la calceina non viene completamente sciolta.
Aggiungere 12,5 millimolare bis-tris e acqua ultrapura per un volume finale di 500 millilitri e regolare il pH a 7,5. Erogare pellicola lipidica in calceina contenente tampone, quindi idratare completamente il lipide riscaldando la sospensione a 65 gradi Celsius per 20 minuti. Forma liposomi di 200 nanometri tramite estrusione con una membrana in policarbonato.
Aggiungere due microgrammi di L-OPA1 in DDM micromolare 0,5, liposoma da 2,2 milligrammi e incubare la soluzione a quattro gradi Celsius per 1,5 ore. Rimuovere il tensioattiva per dialisi con una cassetta di dialisi da 3,5 kilodalton contro 250 millilitri di 25 millimolare bis-tris, cloruro di sodio 150 millimolare e tampone di calcio millimolare a quattro gradi Celsius durante la notte, cambiando il tampone due volte. Rimuovere la calceina aggiuntiva utilizzando una colonna di desalinizzazione PD10, quindi procedere con l'imaging e l'analisi dei dati come descritto nel manoscritto di testo.
Qui sono mostrate immagini di microscopia a epifluorescenza di un bistrato lipidico e della sua fluidità lipidica. La distribuzione lipidica viene mostrata prima e dopo lo sbiancamento fotografico e l'omogeneità viene mostrata prima e dopo la ricostituzione. Il bistrato ricostituito e lipidico L-OPA1 è stato convalidato mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza o FCS.
Le curve FCS indicavano che il 75% dell'L-OPA1 è stato ricostituito nel bistrato lipidico suggerendo che l'L-OPA1 si diffonde liberamente nel bistrato lipidico tethered polimerico con il potenziale di auto-assemblarsi in complessi funzionali. Lo sbiancamento a gradini a fluorescenza indicava che in media da due a tre copie di L-OPA1 erano ricostituite in un dato liposoma. La distribuzione delle dimensioni dei proteoliposome ricostituiti L-OPA1 è stata testata dopo la ricostituzione utilizzando DLS e verificata con FCS.
Il tethering a membrana è stato monitorato osservando il segnale di Texas Red sulla superficie del bistrato lipidico utilizzando la microscopia TIRF. La de-miscelazione lipidica della membrana o l'emifusione sono state monitorate attraverso Texas Red mentre il marcatore liposoma si diffondeva nel bistrato lipidico. La de-tempra della calceina ha aiutato a distinguere la formazione completa dei pori di fusione dalla sola de-miscelazione lipidica, consentendo il confronto tra le condizioni in cui le particelle si bloccano all'emifusione e le particelle che procedono alla fusione completa.
Il tethering a membrana era indicato da un segnale lipidico stabile da liposomi e segnale di effusione non presentava de-tempra nel segnale di calceina, ma un rapido decadimento del segnale rosso del Texas indicava la diffusione del colorante nel bistrato lipidico. La fusione completa presentava sia il decadimento lipidico che il rilascio del contenuto. Quando si tenta questa particella, ricordarsi di pulire accuratamente sia il coperchio che il trogolo di Langmuir per garantire che vengano fabbricati due strati di alta qualità.
Una buona qualità dell'aria è anche fondamentale per prevenire difetti nel bistrato. Questa tecnica ci apre la strada per esplorare nuove domande nella dinamica e nell'organizzazione della membrana dei mitocondri. L'entusiasmante esperimento futuro include l'esplorazione dell'influenza dell'assimetria bistrato, del potenziale della membrana e dei mutanti correlati alle malattie nella dinamica della membrana interna dei mitocondri.
