Uno dei principali vantaggi di questa tecnica per caratterizzare i trasportatori a membrana è che è possibile determinare l'affinità relativa del trasportatore per substrati specifici, nonché ottenere informazioni sul meccanismo di trasporto. La caratterizzazione delle proteine di membrana che utilizzano gradienti proteici per guidare il trasporto del substrato è particolarmente adatta per questo saggio di vescicola inside-out che dimostriamo qui. Mentre questo saggio richiede alcune attrezzature specializzate come una stampa francese e l'accesso a un ultracentrifugo, pensiamo che possa essere tecnicamente più facile di saggi che richiedono la ricostituzione dei trasportatori a membrana in liposomi artificiali.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci consente di quantificare le affinità relative per diversi substrati e fare saggi di competizione per testare l'effetto dei substrati concorrenti sulle griglie di trasporto. Nel caso del trasportatore BAT1 utilizzato per illustrare questo saggio, siamo stati anche in grado di mostrare l'attivazione del substrato del trasportatore da parte dell'arginina. Per iniziare questa procedura, coltura le cellule mutanti E.coli preparate che esprimono la proteina bersaglio inoculando una singola colonia in cinque millilitri di poliammina 3 media con antibiotici appropriati e coltivarla durante la notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno dopo, trasferire questa coltura a 500 millilitri di poliammina fresca 3 media che viene integrata con 0,0002%arabinosi e crescere fino a quando la coltura cellulare raggiunge un OD600 compreso tra 0,6 e 0,8. Dopo questo, centrifuga a 2000 volte G e a quattro gradi Celsius per 15 minuti per raccogliere il pellet cellulare. Sospendere di nuovo il pellet e lavarlo tre volte con tampone uno centrifugando a 2000 volte G e a quattro gradi Celsius per 15 minuti ogni volta.
Il volume finale delle celle nel buffer uno dopo il terzo giro dovrebbe essere di 10 millilitri. Impostare una cella a pressione francese da 35 millilitri e versare la sospensione cellulare nel corpo della cellula. Accendere la macchina con l'interruttore RHS sul retro dell'unità e impostare l'interruttore del selettore del rapporto su alto.
Accendere l'interruttore della pompa. Il pistone inizierà a salire dalla base per spostare l'aria nella camera. Aumentare la pressione ruotando la valvola di aumento della pressione in senso orario fino a quando il misuratore raggiunge 640 PSI.
Questo creerà una pressione interna di 10.000 PSI. Una volta che la cella ha raggiunto la pressione target, aprire leggermente l'assieme della valvola di flusso ruotandolo in senso antiorario. Regolare l'apertura della valvola per consentire una portata di soli circa 10 gocce al minuto.
Quando la linea di arresto sul corpo del pistone raggiunge la parte superiore della cella di flusso, spegnere l'interruttore della pompa. Abbassare la piastra inferiore posizionando l'interruttore del selettore del rapporto verso il basso e quindi, impostando l'interruttore della pompa. Quando la piastra inferiore è completamente retratta, ridurre la pressione del sistema a zero ruotando la valvola di aumento della pressione completamente in senso antiorario.
Spegnere l'interruttore della pompa e spegnere la macchina. Centrifuga la pressa francese eluente a 10.000 volte G e a quattro gradi Celsius per 15 minuti per rimuovere cellule ininterrotte e detriti cellulari. Scartare il pellet e trasferire il supernatante in tubi ultracentrifugo.
Ultracentrifugare il supernatante risultante a 150.000 volte G e a quattro gradi Celsius per un'ora per pellettizzare le vescicole della membrana. Lavare le vescicole della membrana una volta senza ri-sospensione nel tampone due. Quindi, utilizzare una smerigliatrice di tessuto Dounce per sospendere di nuovo le vescicole della membrana nel tampone due.
Preparare 100 aliquote microlitri dei preparati a membrana in tubi di centrifuga da 1,5 millilitri e conservarli a meno 80 Celsius. In primo luogo, lavare e sospendere di nuovo le vescicole in 30 millimolare di Tris a pH 7,8, che contiene 0,1 millimolare di cloruro di cobalto II. Aggiungere un microlitro di carbossipeptidasi A in cloruro di sodio, Tris e cloruro di cobalto II a ogni campione di 100 microliter.
Incubare a 20 gradi Celsius per 20 minuti. Aggiungere cinque microlitri di una soluzione contenente EDTA di sodio e 2-mercaptoetanolo a PH 7,5 per interrompere la digestione. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per un'ora per inattivare completamente l'enzima.
Successivamente, aggiungere da cinque a 10 microlitri di una soluzione contenente solfato di dodecil di litio, glicerolo, blu bromofenolo e Tris a pH da 7,5 a 100 microlitri del campione e analizzare i campioni per elettroforesi. Per eseguire l'aminoblotting, posare un filtro di nitrocellulosa inumidito con fosfato di idrogeno di sodio da 25 millimolare sul gel di poliacrilammide. Posizionare questi tra due filtri di cellulosa inumiditi e, infine, tra due tamponi di plastica inumiditi.
Posizionare questo assemblaggio tra gli elettrodi di una camera contenente 25 millimolare di sodio idrogeno fosfato ad una temperatura compresa tra due e quattro gradi Celsius. Elettrotrasferare le proteine a 20 volt e a due o tre ampere per tre ore. Bloccare la membrana della nitrocellulosa nel tampone di blocco durante la notte a due gradi Celsius.
Il giorno successivo, incubare la nitrocellulosa a 20 millilitri da uno a 5.000 diluizione dell'anticorpo HRP anti-terminale C e tampone di blocco per due ore e lavare due volte con 50 millilitri di tampone per un totale di 60 minuti. Per visualizzare l'ammino macchia, sciogliere sei milligrammi di 4-cloro-1-naftolo in 20 millilitri di alcol denaturato e aggiungere 80 millilitri di Tris millimolare e 50 microlitri di perossido di idrogeno al 30%. Bagnare la carta filtrante in questa soluzione di substrato per 20 minuti.
Quando si è sviluppato un colore sufficiente, sciacquare la membrana con acqua e lasciare asciugare. Per iniziare, incubare l'aliquota di 100 microliter delle vescicole di membrana a 12 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere il tampone 3 contenente poliammine radioetichettate ad una concentrazione finale di 50 micromolari alle vescicole di membrana in tubi microcentrifugo da 1,5 millilitri per avviare il trasporto.
Condurre il saggio di trasporto a 12 gradi Celsius per un minuto. Successivamente, trasferire le miscele di reazione al collettore di filtrazione e filtrarlo attraverso un filtro a membrana di nitrocellulosa da 0,45 micrometri. Aggiungere tre millilitri di tampone di dosaggio ghiacciato contenente una concentrazione dieci volte superiore di poliammine non etichettate, seguiti da tre millilitri di tampone di dosaggio senza le poliammine per ridurre il legame non specifico.
Trasferire i filtri lavati su flaconcini a scintillazione usa e getta da 20 millilitri contenenti 10 millilitri di liquido scintillante e utilizzare un contatore di scintillazione liquida per determinare la radioattività. Calcolare l'assorbimento netto di poliammina come descritto nel protocollo di testo. Determinare il Km per il substrato misurando l'assorbimento del substrato radioetichettato nelle vescicole che esprimono la proteina bersaglio e calcolare la cinetica di Michaelis-Menten usando un metodo di regressione non lineare.
Per gli esperimenti di competizione, aggiungere il substrato competitivo non etichettato realizzato nel tampone di dosaggio al tubo di centrifuga contenente 100 microlitri di vescicole a 12 gradi Celsius, aggiungendo contemporaneamente 50 micromolare della poliammina radioetichettata. Misurare la radioattività intrappolata all'interno delle vescicole come descritto in precedenza. Determinare un KM padre per i substrati competitivi misurando l'assorbimento delle poliammine radioetichettate e la presenza di 100 substrati micromolari o non etichettati superiori e utilizzare un metodo di regressione non lineare per tracciare la curva.
In questo studio, un anti-porter è caratterizzato prima dall'espressione della proteina in E.coli, e poi, generando vescicole di membrana in modo che la proteina espressa eterologamente possa essere saggiata in un sistema privo di cellule. Una macchia occidentale viene utilizzata per verificare che l'AtBAT1 sia traslocato in vescicola. Sondare la macchia con un anticorpo anti-his C-terminale ha rivelato una proteina costrutto di fusione che è di circa 72,3 kilodaltoni.
La digestione delle vescicole prima di SDS-PAGE ha comportato una diminuzione, ma non una completa perdita del segnale della sonda. A 12 gradi Celsius, l'assorbimento di uno spermidina radioetichettato dalle vescicole è più alto a un minuto ed è rimasto lineare per tre minuti. Pertanto, il tempo di incubazione per il saggio di trasporto è fissato a un minuto.
Dopo un minuto, non c'è assorbimento netto di isotopo da vescicole di membrana che sono state preparate e conservate a pH 8.0 in quanto non esiste un gradiente di protone attraverso la membrana vescicolare. Per dimostrare l'effetto della dissipazione del gradiente protonico artificiale, le vescicole di membrana vengono incubate in tampone di pH 8.0 per 10 minuti prima dell'aggiunta del substrato etichettato, portando ad un assorbimento minimo del substrato radioetichettato. Nel complesso, questi risultati indicano che l'assorbimento di spermidina guidato da protoni è dovuto alla proteina BAT1.
Per determinare la specificità del substrato della proteina, i valori di Km vengono calcolati misurando l'assorbimento del substrato radioetichettato a diverse concentrazioni. I valori di Km per spermidina, putrescina e arginina indicano che questa proteina è uno scambiatore di poliammina e arginina ad alta affinità. L'affinità del trasportatore per un particolare substrato può anche essere determinata indirettamente utilizzando saggi di concorrenza.
Questi test rivelano che GABA è un inibitore competitivo dello spermidina. Inoltre, la misurazione dell'assorbimento di 50 micromolari di spermidina radioetichettata in presenza di concentrazioni variabili di diversi amminoacidi rivela che l'AtBAT1 è anche in grado di trasportare glutammato e alanina a concentrazioni millimolari. Quando si esegue questa procedura, l'integrazione del trasportatore di membrane nella membrana batterica è, ovviamente, critica.
La verifica che la proteina di interesse sia integrata nella membrana può essere eseguita utilizzando anticorpi diretti contro i tag del terminale C. La variazione genetica dei trasportatori umani può influenzare il trasporto di, sia, metaboliti che farmaci che sono substrati del particolare trasportatore. Pertanto, la variazione allelica può influenzare, sia, l'assorbimento e l'escrezione di droghe.
Molte varianti alleliche possono essere rapidamente realizzate mediante mutagenesi diretta lateralmente del gene trasportatore in un vettore di espressione. I test funzionali di queste varianti possono quindi essere testati in condizioni molto controllate utilizzando saggi vescicolari interni. I trasportatori a membrana costituiscono da otto a 10 di tutte le proteine e la maggior parte non è stata caratterizzata completamente in nessuno degli organismi modello.
I trasportatori localizzati nelle membrane organelle sono particolarmente difficili da caratterizzare per espressione eterologo nelle cellule eucariotiche. Se il tipo di scambio o i trasportatori mediati da protoni possono essere localizzati in questa membrana E.coli, questi trasportatori possono essere funzionalmente caratterizzati utilizzando questo saggio in vitro. La qualità e la resa delle vescicole sono influenzate dal tasso di eluizione dei frammenti cellulari della stampa francese.
Nel fare saggi di trasporto di vescicole con isotopi, è importante avere una configurazione sperimentale che faciliti la ricerca di repliche sperimentali. Ci sono molti modi per farlo, ma pensiamo che sarà utile per noi mostrarvi come lo abbiamo fatto.
