L'obiettivo generale di questo presente video è quello di spiegare il protocollo di una doppia iniezione diretta di sangue nella cisterna magna come modello di emorragia subaracnoidea. La fisiologia dell'emorragia subaracnoide è spesso dovuta a una rottura di un aneurisma. E prima facciamo l'estravasazione del sangue nel compartimento tra il cervello e il tessuto che copre il cervello.
Questo compartimento è lo spazio subaracnoideo. L'emorragia subaracnoidea rappresenta fino al 7% di tutti i casi di sciopero. La mortalità varia tra il 30 e il 50% negli studi basati sulla popolazione e i sopravvissuti all'emorragia subaracnoide comunemente sperimentano sequele cognitive come deficit di memoria, astenia o disturbi dell'umore.
La causa principale nell'alta prevalenza di scarso risultato è cos'è l'ischemia cerebrale. Gli studi hanno fatto un collegamento tra il verificarsi di ischemia nella vasocostrizione delle grandi arterie cerebrali, chiamato vasospasmo microscopico che può essere rilevato nella maggior parte dei pazienti tra il quarto e il quindicesimo giorno dopo il primo evento di gonfiore. A causa dell'inefficienza delle attuali opzioni terapeutiche, c'è un ovvio bisogno medico per una migliore comprensione degli eventi patologici.
Dovrebbero essere testati l'emorragia subaracnoidea di accompagnamento e nuovi obiettivi terapeutici, ma ciò richiede modelli animali vari e standardizzati. La rottura dell'aneurisma intercranico per lo più responsabile dell'emorragia subaracnoidea nell'uomo è probabilmente difficile da fare modelli preclinici e umani. Negli animali, le principali difficoltà risiedono nell'incidenza di controllo dell'emorragia e della distribuzione del sangue, ma studi recenti si concentrano sullo sviluppo di modelli più redicivi di modelli di emorragia subaracnoidea.
Qui rappresentano un modello di topo standardizzato di due iniezioni consecutive di sangue arterioso autologo dei nostri due giorni nella cisterna magna. I principali vantaggi di questo modello sono padroneggiare riproducibilmente una procedura chirurgica non invasiva, adattare la qualità e la quantità del sangue iniettato e rafforzare l'evento sanguinante senza aumentare drasticamente la pressione intracraniale. Prima dell'inizio dell'intervento chirurgico, è necessario mettere un altro gran numero di capillari di vetro utilizzando un estrattore di micropipette.
La pipetta per iniezione deve presentare un diametro interno di 0,86 millimetri e un diametro esterno di 0,5 millimetri. Preparare il liquido spinale cerebrale artificiale per condizioni fittizie, come indicato nel protocollo scritto. Devi realizzare questo fluido spinale cerebrale artificiale ossigenato con un apparato filtrante da 0,22 micron.
Il primo passo del nostro modello di emorragia subaracnoide consiste nell'isolamento dell'arteria carotide lungo la trachea e nella raccolta del massimo del sangue dalla puntura dell'arteria carotide. Dopo l'anestesia per isoflurane, controllare la mancanza di riflessi bloccando uno o due arti posteriori per consentire l'impostazione della procedura sperimentale. Codificare una siringa da un millimetro con Eprin utilizzando un ago calibro 26.
Ciò impedirà la coagulazione del sangue durante i passaggi successivi. Pesare ogni mouse con precisione utilizzando una bilancia elettronica. Nello studio attuale, i topi avrebbero un peso corporeo nell'intervallo da 20 a 25 grammi poco prima dell'intervento chirurgico.
Come spiegato in precedenza, anestesia indotta del topo azionato e quindi radere il collo e lo spazio tra ogni orecchio per mezzo di un clipper elettrico adatto. Controllare che il mouse dormi e che la testa del mouse sia ben bloccata. Iniettare per via sottocutanea 100 microlitri di buprenorfina a 0,1 milligrammi al chilo con un ago calibro 26 nella parte bassa della schiena per evitare dolore dopo il risveglio.
Prevenire gli occhi asciutti utilizzando un gel liquido protettivo e mantenere la temperatura intraduttale di 37 gradi utilizzando una coperta elettrica regolata automaticamente. Prima di trattare l'area rasata con una soluzione antisettica, tutti gli strumenti che toccano il tessuto sono stati sterilizzati e manipolati aseticamente. Il primo giorno, tagliare un'incisione lunga un centimetro nel collo posteriore, seguita dalla separazione dei muscoli lungo la linea mediana, per accedere alla cisterna magna.
Tagliare la punta della pipetta di vetro vuota con forbici sottili. Quindi adattarsi a una siringa collegata a un connettore in silicio flessibile. Quindi trasferire 60 microlitri di sangue o liquido spinale cerebrale artificiale in un tubo da 0,5 millilitri utilizzando una micropipetta di precisione Succhiare nella pipetta di vetro, i 60 microlitri di sangue per la condizione di emorragia subaracnoidea o 60 microlitri di liquido spinale cerebrale artificiale per la condizione fittizia.
Per l'iniezione, inserire la pipetta sul telaio stereotattico utilizzando, ad esempio, il nostro anello o un e avvicinarsi lentamente alla punta della pipetta alla membrana all'interfaccia con la cisterna magna. Inserire lentamente la punta della pipetta attraverso la membrana atlanto-occipitale nella cisterna magna utilizzando un micromanipolatore del telaio stereotattico. Collegare la pipetta alla siringa precedentemente riempita, pronta per l'induzione della pressione.
Iniettare per pressione a bassa velocità circa 10 microlitri al minuto per evitare ipertensione intracranica acuta. Durante l'iniezione, monitorare attentamente la frequenza respiratoria e la temperatura rettale. Al termine dell'iniezione, togliere con cura la pipetta utilizzando il micromanipolatore e fare attenzione visivamente che non ci siano perdite durante il prelievo.
Ottenere l'omeostasi ed eseguire due suture con filo di sutura intrecciato non assorbibile. Subito dopo l'intervento chirurgico, isolare e posizionare il topo in declino decubito e coprire con una coperta di sopravvivenza in una scatola aperta per tutta la durata del recupero. Dopo 24 ore, indurre nuovamente l'anestesia, installare il mouse sul telaio stereotattico come il giorno prima e rimuovere con cura le suture con micro-forbici.
Preparare come prima asettico della membrana atlanto-occipitale, applicando sulla zona rasata e soluzione aseptica con un'asta di cotone. Iniettare, come il giorno prima, 30 microlitri di sangue o liquido spinale cerebrale artificiale a bassa velocità. Come già accennato, monitorare la frequenza respiratoria e la temperatura rettale.
Al termine dell'iniezione, togliere con cura la pipetta e controllare l'assenza di perdita di sangue durante il prelievo. Ottenere l'omeostasi ed eseguire due suture con un filo di sutura assorbibile intrecciato. Dal primo giorno dopo l'intervento chirurgico al giorno del sacrificio, il peso corporeo deve essere valutato quotidianamente come indicatore sensibile per il benessere generale.
Ha mostrato un significativo aumento di peso corporeo ridotto nell'emorragia subaracnoidea, rispetto agli animali fittizi, suggerendo un processo di recupero dell'attività di lunga durata ed eventi patologici prolungati, emorragia post-sottoaracnoide. Perché la mortalità non è in condizioni fittizie? La mortalità è vicina al 30% al settimo giorno in condizioni di emorragia subaracnoidea, con la maggior parte degli animali che muoiono lo uno o il quarto giorno dopo l'intervento chirurgico.
Tra gli endpoint umani, si nota una significativa perdita di peso superiore al 15% del peso iniziale. Una postura intuizioneta, movimenti lenti, ferite, vocalizzazioni anomale o aggressività significativa sono anche segni che l'animale sta soffrendo. Se appare uno di questi segni o una combinazione di segni, il tracciamento dell'animale viene rinforzato in poche ore che ne seguono l'aspetto.
Se le condizioni dell'animale peggiorano nell'ora che segue o non migliora entro 48 ore, si considererà che viene raggiunto un livello di sofferenza intollerabile e viene eseguita l'uccisione. In questo esempio al primo giorno di chirurgia, può essere osservato da un cervello campione, coaguli di sangue lungo le grandi arterie del poligono di Willis nel soggetto di emorragia subaracnoidea. Al quinto giorno dopo l'intervento chirurgico e prima del sacrificio, l'iniezione intervascolare di inchiostro indiano consente il rilevamento di vasospasmo macroscopico corrispondente alla vasocostrizione di grandi arterie cerebellari, la colorazione delle fette cerebrali con ematossilina ed eosina consente la misurazione del vasospasmo cerebrale.
Qui, come illustrato in questa micrografia fotografica, è possibile osservare come vasospasmo dell'arteria basilare. In questo modello di deviare l'iniezione diretta di sangue nella cisterna magna, abbiamo recentemente dimostrato vasospasmo cerebrale di grandi arterie cerebrali, deposizione fibrilla vascolare cerebrale e apoptosi cellulare, accompagnata da funzioni sensoriali, motorie e cognitive alterate nei topi. Pertanto, rende questo modello convalidato e caratterizzato per eventi a breve termine e di lunga durata, emorragia post-sottoaracnoide.
Dovrebbe essere ideale per l'identificazione prospettica di nuovi obiettivi e per studi su strategie terapeutiche efficienti contro le complicanze associate all'emorragia subaracnoidea.
