Questo protocollo è significativo perché sviluppiamo un modello clinicamente rilevante di danno cerebrale indotto da IVH e idrocefalo, utilizzando l'iniezione di emoglobina nei ventricoli, che consente la successiva quantificazione dei volumi del ventricolo nell'applicazione, per testare nuove strategie terapeutiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo studio della patologia dell'IVH che è specificamente mediata dall'emoglobina e dai prodotti di degradazione del sangue della via del ferro. Questa tecnica è anche facile da usare e versatile.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di terapie per l'idrocefalo post-emorragico, in quanto consente un'ulteriore comprensione della fisiopatologia IVH e la valutazione di strategie di trattamento clinicamente rilevanti per la prevenzione delle sequele neurologiche dopo IVH. A dimostrare la procedura sarà Sruthi Ramagiri, un post-doc associato dell'Australia Laboratory. Per iniziare posizionare il ratto anestetizzato incline nell'apparato stereotassico con il naso posizionato nell'adattatore per anestesia.
Quindi fissare la testa stringendo le barre auricolari non di rottura sul meato uditivo esterno. Per pulire la testa, toccare prima un applicatore sterile con punta di cotone imbevuto di Betadine al centro della testa e spostarsi verso l'esterno per diffondere il Betadine in cerchi. Quindi ripetere il processo con un applicatore imbevuto di etanolo al 70%.
Successivamente, usando un bisturi, fai un'incisione di 0,3 centimetri verticalmente lungo il centro della testa per esporre il bregma del cranio. Quindi asciugare l'area utilizzando un applicatore con punta di cotone. Per impostare l'iniettore stereotassico, aspirare la soluzione di emoglobina precedentemente preparata in una siringa da 0,3 o 0,5 millilitri e posizionare la siringa nel sistema di iniettori stereotassici.
Quindi, attivare l'interfaccia dell'iniettore stereotassico e fare clic sul pulsante di configurazione per inserire il volume di iniezione e le impostazioni della velocità. Fare clic sul volume e impostare il volume su 20.000 nanolitri. Quindi fare clic sulla velocità di infusione e impostare la velocità su 8.000 nanolitri al minuto.
Fare clic sul pulsante di ripristino della posizione per uscire dalla configurazione. Lavare la punta dell'ago facendo clic sul pulsante di infusione fino a quando una piccola perla di emoglobina appare sulla punta dell'ago, quindi utilizzare un applicatore con punta di cotone per rimuovere delicatamente il tallone. Per iniziare l'iniezione animale, impostare il bregma come zero sul sistema di iniezione stereotassica regolando le posizioni mediolaterale e anteroposteriore della siringa.
Quindi abbassare l'ago della siringa per toccare delicatamente il cranio al bregma. Dopo aver identificato le coordinate di scelta, sollevare l'ago della siringa un centimetro sopra il cranio per liberare il cuoio capelluto. Impostare le coordinate mediolaterali e anteroposteriori.
Quindi abbassare la siringa affinché l'ago tocchi delicatamente il cranio e impostare la coordinata dorsoventrale nell'arco di 30 secondi. Una volta impostate le coordinate, iniziare l'iniezione facendo clic sul pulsante di esecuzione sull'interfaccia dell'iniettore stereotassico. Al termine dell'iniezione, lasciare l'ago in posizione per due minuti per ridurre al minimo il riflusso della soluzione.
Quindi, ritirare lentamente la siringa lungo la coordinata dorsoventrale per due minuti, fino a quando la punta dell'ago è due centimetri sopra il cuoio capelluto. Quindi ruotare il braccio iniettore stereotassico lontano dal campo operatorio e chiudere il cuoio capelluto con una sutura monofilamento 6-O. Per la risonanza magnetica, eseguire l'imaging pesato T2 selezionando una sequenza di eco a rotazione rapida pesata T2.
Dopo aver impostato i parametri MRI come descritto nel testo, fare clic sul pulsante Continua per avviare la sequenza. Per l'elaborazione delle immagini e l'analisi del volume cerebrale, aprire i dati pesati T2 nativi nel software di segmentazione. Per delineare manualmente i ventricoli laterali, fare clic sulla modalità pennello e selezionare lo stile del pennello quadrato, quindi regolare la dimensione del pennello su uno.
Quindi, fai clic su Impostazioni layout, seleziona Vista assiale e fai clic su Zoom per adattare. Quindi posizionare il cursore sull'immagine e tracciare e riempire lo spazio del ventricolo laterale. Infine, fai clic sulla segmentazione nella barra degli strumenti, seguita da volume e statistiche per visualizzare i volumi segmentati.
Gli animali sottoposti a iniezione di emoglobina hanno sviluppato ventricolomegalia moderata quando valutati tramite risonanza magnetica. Con ventricoli laterali significativamente più grandi a 24 ore e 72 ore dopo l'iniezione di emoglobina, rispetto agli animali iniettati con ACSF. Sebbene la differenza nel volume ventricolare laterale tra i due gruppi di ratti non fosse significativa dopo 38 giorni, le scansioni MRI hanno dimostrato che il 44% dei ratti trattati con emoglobina aveva ancora ventricolomegalia irrisolta.
Inoltre, rispetto all'ACSF, l'iniezione di emoglobina ha comportato una significativa diminuzione del volume della sostanza bianca dopo 38 giorni. L'emoglobina ha anche promosso una risposta infiammatoria in vivo, come evidente dal livello significativamente più alto del fattore di necrosi tumorale delle citochine pro-infiammatorie alfa dopo l'iniezione di emoglobina, ma non di sangue salino o intero. Inoltre, la colorazione immunoistochimica della proteina acida fibrillare gliale ha rivelato un'attivazione significativamente più elevata degli astrociti dopo l'iniezione di emoglobina, rispetto a dopo l'iniezione di ACSF.
La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è impostare le coordinate di iniezione corrette per garantire la consegna dell'emoglobina nei ventricoli laterali. Seguendo questa procedura, i traccianti CSF possono essere consegnati nello spazio CSF per valutare i cambiamenti nella circolazione del CSF e i modelli di efflusso dopo IVH. Questo metodo aggiuntivo affronta il modo in cui il flusso CSF viene alterato in IVH PHH.
