Il nostro protocollo è significativo perché consente ai ricercatori che lavorano su funghi non modello l'opportunità di stabilire tecnologie di editing del genoma all'avanguardia nei loro laboratori. Poiché non si basa su tecniche esistenti, come i sistemi di espressione, questo protocollo ha il vantaggio di essere più facile da stabilire nei sistemi non modello. Questo metodo può essere utilizzato in diverse specie di funghi e può essere utilizzato per chiarire le funzioni dei geni coinvolti nell'accoppiamento delle vie, nella crescita e nella patogenicità.
Quindi, quando si esegue questa procedura, bisogna essere sicuri di avere abbastanza giorni consecutivi per competere con il protocollo in quanto ci sono solo pochi punti nell'esperimento in cui può essere messo in pausa. Per raccogliere la conidia, filtrare la coltura liquida attraverso uno strato di panno da laboratorio sterile in tubi di centrifuga da 50 millilitri per la centrifugazione. Resuspend il pellet di conidia in cinque millilitri di acqua e visualizzare un'aliquota di 10 microlitri della soluzione di conidia al microscopio leggero con un ingrandimento del 40% per confermare che solo la conidia è stata recuperata.
Aggiungere quindi 200 millilitri di brodo fresco all'1% di estratto di malto in un pallone da 500 millilitri e trasferire l'intero volume di conidia nel pallone. Quindi incubare la coltura liquida per un massimo di 12 ore in un incubatore di scuotimento di 25 gradi Celsius a 120 giri al minuto. Per raccogliere le germinazioni, trasferire la coltura in tubi di centrifuga da 50 millilitri per la centrifugazione e rimorsire le germinazioni in un massimo di 10 millilitri di un sorbitolo molare.
Aggiungere un millilitro di soluzione germinale a varie concentrazioni di soluzione enzimatica e incubare la soluzione enzimatica delle spore per due o tre ore nell'incubatore di scuotimento a 80 giri al minuto. Per raccogliere i protoplasti, filtrare la soluzione enzimatica attraverso uno strato di tessuto di laboratorio sterile e raccogliere i protoplasti per centrifugazione. Quindi resostigliere con cura il pellet di protoplasto in 200 microlitri di tampone STC e controllare un'aliquota di 10 microlitri della soluzione al microscopio per confermare che solo i protoplasti sono stati recuperati.
Per iniziare la trasformazione, combinare circa cinque volte 10 ai sei protoplasti con un singolo volume di soluzione di ribonucleoproteina e circa sei microgrammi del frammento di DNA del donatore. Successivamente, utilizzare una pipetta per gocciolare lentamente e uniformemente un millilitro di soluzione 30%PTC appena preparata sulla sospensione del protoplasto per creare uno strato idrofobico sui protoplasti e incubare la soluzione per 20 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere cinque millilitri di mezzo di controllo osmotico alla sospensione del protoplasto, pipettando lentamente e delicatamente per mescolare accuratamente la soluzione.
Dopo la miscelazione, incubare la soluzione di protoplasto nell'incubatore di scuotimento a 80 giri al minuto durante la notte. La mattina seguente, dividere la soluzione tra cinque piastre di coltura da 60 millimetri. Aggiungere 10 millilitri di agar medio di controllo osmotico integrato con 30 microgrammi per millilitro di igromicina B ad ogni piastra e ruotare lentamente ogni piastra per mescolare.
Lasciare impostare il primo strato di agar prima di aggiungere 10 millilitri di agar medio di controllo osmotico integrato con 40 microgrammi per millilitro di igromicina B due per piastra. Dopo aver permesso al secondo strato di agar di impostare, incubare le colture a 25 gradi Celsius fino a quando non si possono osservare singoli isolati che crescono attraverso entrambi gli strati di agar. Per recuperare gli isolati trasformati con successo, trasferire i singoli isolati capaci di crescita su piastre di agar di estratto di malto fresco integrate con 50 microgrammi per millilitro di igromicina B.To valutare gli effetti dell'interruzione genica mirata sulle capacità eterotalliche del fungo, co-inoculare il mezzo agar estratto di malto fresco con un ceppo mutante e un ceppo del tipo di accoppiamento opposto.
Quando si lavora con H.omanensis, coprire ma non sigillare le piastre. Posizionare le piastre a temperatura ambiente per sette giorni. Alla fine dell'incubazione, valutare visivamente per la produzione di strutture sessuali.
Per testare le capacità omotalliche del ceppo mutante, inoculare il mezzo di agar estratto di malto fresco con il ceppo mutante di interesse e incubare la piastra a temperatura ambiente per una settimana, come dimostrato. Per valutare gli effetti della perturbazione sul tasso di crescita del fungo in esame, inserire il retro di una grande punta sterile di pipetta nei bordi attivamente crescenti della coltura di ogni ceppo mutante e di tipo selvaggio di interesse per creare tappi di agar coperti miceliali e inoculare il mezzo di agar estratto di malto fresco. È necessario eseguire almeno tre repliche per tipo di coltura.
Dopo tre giorni di crescita a 20 gradi Celsius, misurare la crescita in ogni piastra su due diametri perpendicolari. La conidia utilizzata come materiale di partenza per il protocollo può germogliare e crescere fino a diventare giovani germinali. Si noti che i filamenti miceliali maturi come questi sono troppo maturi per la degradazione e non devono essere utilizzati.
Quando le cellule non hanno più pareti cellulari, diventano molto sensibili all'interruzione meccanica e rilasciano protoplasti rotondi che possono essere raccolti per la trasformazione. Il successo del protocollo può essere confermato su un'analisi fenotipico dei ceppi mutanti. Per questo isolato mutante MAT 127, il tasso di crescita radiale vegetativo fu significativamente ridotto, suggerendo un effetto pleiotropico per il nuovo gene di accoppiamento.
Inoltre, l'isolato mutante era incapace di completare un ciclo sessuale producendo solo strutture sessuali immature che non producevano spore sessuali rispetto all'isolato di tipo selvaggio che completava l'intero ciclo sessuale entro pochi giorni dall'incubazione. L'RNA è molto sensibile e si degrada molto facilmente. Pertanto, un ambiente di lavoro pulito e lavorare rapidamente sul ghiaccio sono entrambi essenziali per il successo di questo esperimento.
Una volta che l'isolato mutante è stato generato con successo, possono essere sottoposti ad analisi fenotipiche o RNA-seq come appropriato per il gene che viene caratterizzato.
