smFISH è noto per misurare il numero assoluto come posizione subcellulare degli mRNA. Il nostro protocollo sMFISH a due colori ha la capacità di misurare la cinetica della trascrizione e della degradazione dell'mRNA. Utilizzando questo metodo, molti campioni possono essere elaborati contemporaneamente senza tempi o sforzi aggiuntivi.
Ad esempio, quattro esperimenti di corsi di tempo che producono 48 campioni possono essere elaborati per l'imaging in otto ore. Il nostro protocollo è ampiamente applicabile a molti geni e specie batteriche. Per preparare vetrini di copertura e vetrini per l'esperimento.
Utilizzare le forcep per posizionare scivoli di copertura e scivoli in un barattolo coplin contenente 100% di etanolo e posizionare il barattolo in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 15-20 minuti. Al termine della sonicazione lavare gli scivoli e il coperchio scivola da tre a quattro volte con acqua ultra pura prima di riempire il barattolo con il 70% di etanolo e ripetere la sonicazione. Al termine di tutte le fasi di sonicazione, asciugare i coperchi e gli scivoli con gas azoto.
Posizionare il coperchio scivola in una scatola di punta vuota di pipetta da 1000 microliter e posizionare le diapositive in una scatola scorrevole pulita. Quindi, seguendo i fori della scatola di punta della pipetta, utilizzare un marcatore idrofobico per disegnare cerchi sui coperchi e applicare una goccia di 20 microliter dello 0,1% di lisina poli l a ciascuno di questi pozzi. Per impostare un esperimento di corso del tempo, aggiungere 750 microlitri da una coltura E.coli in crescita esponenziale di 20 millilitri a un tubo di coltura da 1,5 millilitri contrassegnato con il tempo zero.
E invertire immediatamente il tubo. Indurre l'espressione lac Z con IPTG da 0,2 a un millimolare e avviare un timer. Dopo aver controllato il timer, raccogliere la coltura cellulare in ogni punto di tempo sperimentale consecutivo come appena dimostrato.
Nel momento appropriato durante l'esperimento, aggiungere cinque ONPF millimolare al pallone per reprimere l'espressione Z della lac e continuare a campionare le colture per tenere traccia della degradazione dell'mRNA. Al termine dell'acquisizione del campione del corso di tempo, incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti seguiti dall'incubazione sul ghiaccio per 30 minuti. Al termine della centrifugazione di incubazione i campioni per rimuovere il fissatore e utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante.
Sospendere di nuovo i batteri in un millilitro di DEPC PBS e lavare le cellule altre due volte in un millilitro di PBS DEPC fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere di nuovo le celle in 30 microlitri di PBS DEPC fresco. Per la permeabilità delle cellule.
Per prima cosa aggiungi il campione da ogni punto di tempo ai singoli pozzi idrofobici su uno dei vetri sterilizzati a etanolo. E consentire alle cellule di aderire allo scivolo di copertura con un'incubazione da 10 a 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 15 microlitri di 70% di etanolo a ciascun pozzo.
Dopo quattro minuti, aspirare l'etanolo da ogni pozzo in modo che i pozzi siano completamente asciutti. Dopo il lavaggio aggiungere 30 microlitri di soluzione di pre ibridazione ad ogni pozzo di cellule permeabilizzate e incubare le cellule per 30 minuti in un forno a 37 gradi Celsius. Sostituire la soluzione di pre ibridazione con circa 30 microlitri di soluzione di ibridazione a sonda per pozzo.
E coprire la camera con un foglio di alluminio per un'incubazione di due ore nel forno a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione utilizzare una pipetta multicanale per risciacquare i pozzi da tre a cinque volte con 30 microlitri di soluzione di lavaggio per pozzo per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare le cellule per 15-30 minuti a 37 gradi Celsius prima di lavare i pozzi cinque volte con 30 microlitri di PBS DEPC fresco per lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare tutto il liquido dallo scivolo di copertura. E aggiungere quattro microlitri di PBS DEPC fresco ad ogni pozzo. Utilizzare le forcep per posizionare con cura lo scivolamento del coperchio su un lato del campione di vetro sterilizzato a etanolo verso il basso e utilizzare gomma dentale in silicone per sigillare i bordi dello scivolo di copertura.
Per individuare un'area di interesse, selezionare la modalità live di imaging a contrasto di fase e manovrare il joystick dello stadio per cambiare il campo visivo all'interno di un pozzo. Situato un'area in cui la densità cellulare è ottimale e regolare la messa a fuoco Z in modo che le immagini delle celle a contrasto di fase siano a fuoco. Quindi acquisire un'immagine C cinque con un'esposizione di quattro secondi, un'immagine C tre con un'esposizione di due secondi e un'immagine di contrasto di fase con un'esposizione di 0,2 secondi per circa 10 aree diverse per pozzo.
In alternativa, è possibile eseguire un'acquisizione NDI in cui le immagini C cinque, C tre e di contrasto di fase vengono acquisite in serie. Una volta che tutti i pozzi sono stati imageati, aprire uno strumento di segmentazione delle celle appropriato e annullare il clic sulla pila. Caricare le immagini di contrasto di fase di interesse e selezionare fotogrammi indipendenti e fare clic sul profilo di fase di calcolo come zero.
Per iniziare il processo di segmentazione durante il quale verranno identificate le celle e verranno calcolati i loro contorni. Caricare i parametri forniti nella cartella GitHub e fare clic su tutti i frame. Al termine dell'elaborazione, selezionate il contorno per visualizzare la mesh.
Successivamente, sotto la scheda di rilevamento spot, deselezionare la pila, controllare le mesh e fare clic su strofinare per iniziare l'identificazione e la quantificazione del punto in base al raccordo gaussiano D. Selezionare la cartella contenente le immagini fluorescenti e il file mesh appena calcolato dalla procedura di rilevamento delle celle e indicare il nome del file in cui verranno salvati i risultati del rilevamento spot. Quindi usa il flusso di lavoro di analisi delle immagini fornito su GitHub per analizzare le immagini a fluorescenza.
In questo campo visivo completo si possono osservare circa 500 cellule E.coli ad una buona densità per la segmentazione cellulare. La morfologia delle cellule nelle immagini di contrasto di fase dovrebbe rimanere paragonabile a quella delle cellule vive ai fini della segmentazione. Se le cellule sono sovra permeabili, la loro morfologia diventerà inadatta alla segmentazione.
La distribuzione delle intensità del punto di mRNA Z lac prima dell'induzione non si adatta bene a una distribuzione normale o poisson a causa della presenza di macchie con elevate intensità. Quando l'espressione del lac Z è indotta il segnale di cinque mRNA Z lac primi aumenta prima che il segnale mRNA Z lac primo aumenti. Se l'espressione del lac Z viene repressa, entrambi i segnali di mRNA Z lac a cinque e tre primi diminuiscono.
Per ottenere la velocità di allungamento della trascrizione, l'ascesa dei cinque e tre segnali primi è adatta alle linee. Mentre la velocità di degradazione dell'mRNA si ottiene adattando la regione di decadimento con una funzione esponenziale. Poiché il pesce a singola molecola è una tecnica a singola cellula, è anche possibile analizzare le variabilità da cellula a cellula nella trascrizione.
Inoltre, l'analisi della colocalizzazione di cinque mRNA Z lac primi e tre primi permette di quantificare la densità delle RNA polimerasi sul gene Z laco. Poiché campioni provenienti da diversi punti di tempo vengono gestiti contemporaneamente durante questa procedura. È importante mantenere il campione separato mentre si trova nei tubi e sullo scivolo di copertura.
Usando questa tecnica di microscopia a singola molecola a singola cellula. I ricercatori possono ora esplorare come la trascrizione e la cinetica della degradazione dell'mRNA siano correlate ai numeri assoluti o alle posizioni subcellulari degli mRNA.
