L'obiettivo generale di questo paradigma è valutare un comportamento difensivo complesso nei roditori. Questo protocollo è significativo perché facilita le indagini sulle transizioni tra comportamenti difensivi, rendendolo ideale per i ricercatori interessati a studiare complesse risposte adattive alla minaccia. Questo protocollo utilizza stimoli di condizione temporaneamente precisi per ottenere la transizione tra le risposte difensive, permettendoci di studiare entrambi, il congelamento condizionato e i comportamenti di volo all'interno del singolo soggetto.
L'uso di questo modello per scoprire i meccanismi del comportamento difensivo può fornire informazioni sulla disfunzione legata alla PTSD e sui disturbi del panico e potrebbe aiutare nello sviluppo di nuove terapie. Per impostare i protocolli comportamentali, nel programma, definire la SCS, impostando gli stimoli da fornire come un tono puro di dieci secondi, o un rumore bianco di dieci secondi, e definendo gli intervalli inter-trial da presentare pseudo-casualmente dopo ogni prova. Per impostare il rilevamento software, posizionare un mouse di prova in ogni contesto pertinente, definire il centro di gravità e regolare le dimensioni del contorno.
Utilizzare le dimensioni delle camere e le dimensioni in pixel della fotocamera per determinare il coefficiente di calibrazione. Quindi, generare il codice di impulso TTL per sincronizzare gli indicatori di evento del computer centrale con le loro occorrenze in tempo reale. Prima di iniziare un esperimento, accendi il controller della scatola di condizionamento della paura, lo shocker e il software di registrazione video.
Montare un altoparlante sopra i contesti per la consegna degli stimoli uditivi a 75 decibel e impostare un generatore audio programmabile per generare stimoli uditivi su una pianificazione predefinita. Dopo aver confermato che il rumore tono e bianco sono funzionali, impostare il sistema per l'acquisizione dei dati e trasportare topi maschi o femmine di tre o cinque mesi nella sala di condizionamento. Prima di iniziare la prova di precondizione, pulire una camera in plexiglass cilindrico trasparente alta 30 centimetri con acido acetico dell'1% da utilizzare come camera di contesto A.
Per la precondizione, posizionare il mouse nel contesto A e consentirgli di acclimatarsi per tre minuti prima di esporre il mouse a quattro percorsi SCS di 20 secondi con un intervallo inter-trial pseudo-casuale medio di 90 secondi. Dopo 10 minuti di acclimatazione, trasferire un mouse nella camera di contesto A e attivare immediatamente il sistema di condizionamento della paura e i programmi di raccolta dei dati. Prima di iniziare un esperimento di condizionamento della paura, pulire un involucro rettangolare alto almeno 35 centimetri, 25 per 30 centimetri con un pavimento a griglia elettrica con 70%etanolo da utilizzare come camera di contesto B.
Quindi, collegare l'ammortizzatore con il pavimento della griglia elettrica della camera Di contesto B e definire la frequenza, l'insorgenza e la durata degli urti nel programma per computer appropriato. Una volta impostati tutti i parametri, verificare che l'intensità dell'urto sia erogata correttamente sia dall'ammortizzatore che dal pavimento della griglia. Nei giorni due e tre, posizionare il mouse nella camera di contesto B per tre minuti prima di esporre l'animale a cinque accoppiamenti della co-terminazione SCS con uno shock del piede AC di un secondo, 0,9 milliamp e un intervallo medio inter-trial di 120 secondi.
Alla fine della sessione, rimettere il mouse nella gabbia di casa. A seconda dell'obiettivo dell'esperimento, sottoscrivere gli animali a una sessione di richiamo, il quarto giorno, posizionare il mouse nella camera di contesto A per tre minuti prima di presentare all'animale quattro prove SCS senza shock del piede con un intervallo inter-trial pseudo-casuale medio di 90 secondi per 590 secondi per testare la risposta fear recall dell'animale. Oppure, per testare Fear Extinction, il quarto giorno, posiziona il mouse nella camera Context B per tre minuti prima di sottoscrivere l'animale a 16 prove di SCS senza shock del piede con un intervallo inter-trial pseudo-casuale medio di 90 secondi per un periodo di 1.910 secondi.
Per quantificare il comportamento del mouse, alla fine dell'esperimento, fare in modo che un osservatore cieco all'analisi segni i video registrati per il comportamento di congelamento utilizzando la soglia automatica del rilevatore di congelamento seguita da un'analisi fotogramma per fotogramma delle modifiche dei pixel. Definire il congelamento come una cessazione completa dei movimenti corporei, ad eccezione di quelli necessari per la respirazione per un minimo di un secondo. Segna un salto come istanza quando tutte e quattro le zampe lasciano il pavimento, con conseguente movimento verticale e/o orizzontale.
Quando l'intero segmento è stato analizzato, esportare il file contrassegnato con marcatori di blocco, salto ed evento ed estrarre gli eventi pertinenti dai periodi di tempo definiti di interesse in un foglio di calcolo. Per calcolare la durata del congelamento, sottrarre l'ora di inizio dall'ora di fine per ogni rispettivo periodo di prova. Sommare il numero totale di salti da una particolare durata di prova.
Per calcolare la velocità del mouse, tracciate le coordinate dal movimento dell'asse XY fotogramma per fotogramma del centro di gravità del mouse. Per calcolare i punteggi di volo, dividere la velocità media durante ogni SCS per la velocità media durante il pre-SCS di dieci secondi e aggiungere un punto per ogni salto di fuga. Un punteggio di volo di uno indica nessun cambiamento nel comportamento di volo dal periodo pre-SCS.
Quindi, analizzare i dati per la significatività statistica utilizzando un programma software di analisi statistica appropriato. Le presentazioni SCS nella sessione di pre-esposizione non suscitano risposte di volo o congelamento nei topi. L'analisi comportamentale durante il condizionamento rivela che il componente Tone della SCS migliora significativamente il congelamento rispetto al congelamento durante il pre-SCS.
I punteggi dei voli sono cambiati in modo significativo durante le sessioni e i topi mostrano velocità più elevate e più salti al segnale rumore bianco rispetto al segnale tono. I topi mostrano una chiara transizione del comportamento difensivo, che mostra punteggi di volo più bassi durante il Tone e punteggi di volo più alti durante il Rumore Bianco, con l'opposto osservato per le risposte di congelamento. I topi sottoposti a 16 prove di addestramento all'estinzione dimostrano una rapida estinzione del volo condizionato, con punteggi di combattimento durante il primo blocco di quattro prove che misurano più in alto durante il rumore bianco rispetto al segnale tono.
Alla fine della sessione di estinzione, il comportamento di volo non è più suscitato da nessuno dei due segnali. Il congelamento al tono è significativamente più alto del congelamento al Rumore Bianco per il primo blocco di quattro prove durante l'estinzione. Il congelamento indotto dal tono diminuisce nei 16 studi di estinzione, mentre si osserva un aumento del congelamento mediato dal rumore bianco.
Nella sessione di richiamo, l'esposizione al rumore bianco in un contesto neutro non suscita il volo, poiché i punteggi dei voli sono inferiori a uno. Piuttosto, le presentazioni white noise nel contesto neutro suscitano risposte di congelamento superiori a quelle suscitate dal tono. È importante pulire il contesto in tutto il tempo ed è fondamentale testare l'ampiezza degli urti e il livello di pressione sonora prima di iniziare un esperimento.
Questo paradigma è attualmente utilizzato da gruppi che sono interessati a comprendere le complessità del comportamento difensivo e possono essere utilizzati per promuovere la nostra comprensione della selezione dell'azione difensiva.
