우리의 프로토콜은 마우스 비장과 림프절이 꾸준한 상태 페노티픽 스냅 샷을 제공하는 것보다 T 세포 반응의 역학을 반영하는 데 사용할 수있는 실용적인 접근 방식을 제공합니다. 우리의 기술은 지속적인 반응에 종사하는 항원 특이적 CD8 T 세포를 민감하게 감지합니다. 증식 CD8 T 세포는 생체 내 약물 치료 또는 세포 전달의 혼동 효과 없이 측정된다.
우리의 기술은 여러 설정에서 면역 역학의 창을 제공 할 수 있습니다. 예를 들면, 예방 접종 및 감염, 자가 면역 질환 및 암 면역 요법에 대한 반응과 관련하여. 증류수로 10배 의 충류 버퍼를 희석하여 신선한 1배 의 충류 세척 버퍼를 준비하고 0.45 마이크로미터 필터를 통해 걸러하여 골재를 제거합니다.
단일 클론 항체 Ki67 FITC를 1배 의 충혈 세척 버퍼로 희석하여 시료당 100 마이크로리터의 최종 부피에 대한 적정 실험으로 결정하였다. 1x 투과성 세척 버퍼3밀리리터를 각 튜브에 세포와 원심분리기를 400G의 400G에 넣고 실온에서 5분간 추가합니다. 상부체를 폐기합니다.
다시, 1x 충류 세척 버퍼와 원심분리기를 추가하여 세포를 펠릿합니다. 그런 다음 상체를 폐기하십시오. 희석된 단일 클론 항체 Ki67 FITC 100 마이크로리터를 펠릿에 넣고 소용돌이에 넣고 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.
인큐베이션 후, 1배 의 투과화 버퍼 4밀리리터로 세포를 두 번 씻고, 매 세척 후 원심분리를 하고, 상체를 폐기한다. 350마이크로리터의 PBS를 세포 펠릿에 추가하여 시료를 혈중 세포계에서 직접 획득할 수 있고 250마이크로리터의 PBS를 세포 펠릿에 첨가하여 DNA 염색을 위해 Hoechst로 배양할 샘플을 허용합니다. Hoechst 및 PBS 용액을 준비하고 최종 농도가 밀리리터 당 2 마이크로그램되도록 각 샘플에 추가합니다.
소용돌이와 어둠 속에서 15 분 동안 샘플을 배양하십시오. 그런 다음 샘플을 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿에 PBS 350 마이크로리터를 추가합니다. 소프트웨어를 열고 작업 영역 리본 섹션에서 그룹 만들기"를 클릭하여 분석할 서로 다른 장기에 해당하는 다른 그룹을 만듭니다.
그룹 이름을 두 번 클릭하여 수정된 그룹 창을 열고 동기화된 함수에 체크 표시를 삽입하여 새로 만든 그룹을 동기화합니다. 각 FCS 파일을 해당 그룹으로 드래그한 다음 A-LN 그룹으로 시작하는 게이팅 전략을 만듭니다. 완전히 스테인드된 샘플을 두 번 클릭하여 그래프 창을 열어 점 플롯에 샘플에 대해 획득한 웅여진 이벤트를 표시합니다.
x축과 y축은 이 원고의 흐름 사이토미터 설정 파일의 표 2에 표시된 대로 FCS 파일과 같이 레이블이 지정됩니다. 적절한 시각화를 위해 충분한 수의 이벤트가 표시되는지 확인합니다. 필요한 경우 작업 공간 리본의 하트 아이콘을 클릭하여 기본 설정을 열고 그래프 유형으로 그래프 플롯을 선택한 다음 해당 상자에 그려진 점 수가 올바른지 또는 변경합니다.
y축의 x축에 DNA-A와 DNA-W가 있는 도트 플롯에 그래프 창에 있는 웅힌 이벤트를 표시합니다. 두 축모두에 선형 축을 사용합니다. 필요한 경우 그래프 창의 각 축에 T가 가깝게 표시된 상자를 클릭하여 logarithmic에서 선형으로 조정합니다.
게이팅 도구 섹션의 직사각형을 클릭하여 단일 셀 모집단을 선택한 다음 직사각형 게이트의 중앙을 두 번 클릭하여 x 축에 FSC-A 매개 변수가 있는 도트 플롯에 단일 셀을 표시하고 y축에서 죽은 셀이 죽는다. 다각형을 클릭하여 죽은 세포 다이에 대해 부정적인 살아있는 세포 집단을 선택합니다. 다각형 게이트의 중앙을 두 번 클릭하여 x 축의 FSC-A 매개 변수와 y축의 SSC-A 매개 변수를 사용하여 점 플롯에 셀을 표시합니다.
사각형을 클릭하고 해당 그래프에 모든 단일 라이브 셀을 포함하도록 편안한 게이트를 만듭니다. 완화된 게이트 의 중앙을 두 번 클릭하여 x축에 CD3가 있는 점 플롯에 셀을 표시하고 y축의 CD8을 표시합니다. 그래프 창에서 시각화에 적합한 액세스 척도를 사용합니다.
필요한 경우 각 축에 T가 가깝게 표시된 상자를 클릭하여 x 및 y 스케일을 수정하고 Access 함수 사용자 지정을 선택하고 필요에 따라 기본 및 긍정적 수십 년 으로 추가 neg 수십 년을 수정합니다. 다각형을 클릭하여 CD3+CD8+셀을 선택합니다. CD3+CD8+게이트 중앙을 두 번 클릭하여 x축의 Tetr-gag와 y축의 펜트 개그와 함께 점 플롯에 셀을 표시합니다.
다각형을 클릭하여 항원 특이적 CD8 T 세포를 선택한다. 개그 별 게이트의 중앙을 두 번 클릭하여 x 축에 DNA-A가 있는 점 플롯에 세포를 표시하고 y축의 Ki67을 표시합니다. 그래프 창의 게이팅 도구 섹션에서 Quad"를 클릭하여 다른 세포 주기 단계에서 셀을 선택합니다.
한 샘플에서 만든 게이팅 전략을 해당 그룹에 복사하여 그룹의 모든 샘플에 게이트를 적용합니다. 그런 다음 텍스트 원고에 설명된 대로 b-비장 및 CBM 그룹에 대한 게이팅 전략을 복사합니다. 모든 게이트가 세 그룹의 각 샘플에 적합한지 확인합니다.
필요한 경우 그룹을 비동기화하고 원고에 설명된 대로 게이트를 수정합니다. y축에 있는 x축및 Ki67에 DNA-A를 사용하여 점 플롯에 편안한 게이트의 BM 셀을 표시합니다. 작업 공간 리본 섹션에서 레이아웃 편집기"를 클릭하여 결과를 시각화합니다.
샘플 창의 게이팅 전략의 각 게이트를 레이아웃 편집기로 드래그하고 게이팅 시퀀스에 따라 플롯을 배치합니다. 필요한 경우 레이아웃의 해당 플롯을 두 번 클릭하고 그래프 정의 창에서 적절한 형식을 선택하여 그래프 유형을 변경합니다. 각 기관에서 항원 별 CD8 T 세포에서 얻은 결과를 시각화하고 다른 샘플을 비교하기 위해 레이아웃 리본의 함수에 의해 반복하고 반복합니다.
양수 조절을 나타내는 골수 세포의 결과를 시각화합니다. 골수 세포의 세포 주기 분석의 전형적인 예는 여기에 도시된다. 이 프로토콜은 G0에서 G1및 G2내지 M DNA 피크의 낮은 계수를 산출하여 DNA 염색의 우수한 품질을 나타냅니다.
항원 특이적 CD8 세포를 식별하기 위해 5단계 게이팅 전략이 사용되었다. 2개의 멀티머는 치료되지 않은 마우스에 있는 염색 배경을 증가하지 않고 백신 접종마우스에 있는 개그 특정 CD8 T 세포 검출의 감도를 향상시키기 위하여 이용되었습니다. 개그 별 CD8 T 세포는 배수 림프절과 비장에서 3 일째에 S-G2/M 단계에서 세포의 높은 비율을 포함 하 여 부스트.
더욱이, S-G2/M 단계에서 개그 특이적 CD8 T 세포는 동일한 장기로부터 총 CD8 T 세포에 오버레이될 때 높은 FSC-A 및 SSC-A를 가졌다. 오프셋 히스토그램은 개그 특정 CD8 T 세포에 의한 CD62L 발현이 림프절에서 G0의 몇 세포를 제외하고 활성화된 T 세포에 대해 예상대로 낮았다는 것을 보여주었다. 이 방법은 T 세포가 멤브레인 및 Ki67 염색과 함께 DNA 염색의 우수한 품질을 달성하기 위해 설계되었습니다.
유동 세포측정 데이터 분석이 핵심 포인트입니다. 게이트 포지셔닝에 적절한 제어를 사용해야 합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 마우스와 인간 말초 혈액에 있는 세포 주기의 S-G2/M 단계에서 T 세포를 발견했습니다.
이 기술은 타입-1 당뇨병, 전염하는 단핵구증 및 COVID-19에 있는 면역 감시 연구 결과에서 유용했습니다.
