Questo lavoro di ricerca ha ricevuto un sostegno finanziario dall'Unione europea (transMed; H2020-MSCA-765441), il Consiglio tedesco delle ricerche (DFG; PA1751/8-1, 10-1) e il Consiglio delle borse di studio per la Cina.

I protocolli sugli animali conformi al §4 della legge tedesca sulla protezione degli animali sono stati esaminati e approvati dal comitato dell'Università di Tubinga per la protezione degli animali(Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; N. registrazione AK02/19M). In questo studio, le retine sono state ottenute da topi di tipo selvatico (WT) e rd1, quest'ultimo è un modello ben caratterizzato per la degenerazione retinicaereditaria 15. I topi erano alloggiati sotto l'illuminazione ciclica bianca standard, avevano libero accesso al cibo e all'acqua e venivano utilizzati indipendentemente dal sesso.
1. Lista di controllo
<ol><li>Per garantire condizioni sterili ed evitare contaminazioni, pulire e disinfettare la cappa di flusso d'aria laminare con il 70% di etanolo. Assicurati di lasciare evaporare completamente l'etanolo, per prevenire l'intossicazione delle colture retiniche.</li>
	<li>Strumenti autoclave (ad esempio forbici, forcette e cucchiaio raschiante al microscopio oftalmico) prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare in anticipo i seguenti supporti sotto una cappa a flusso laminare, in condizioni sterili: Basal R16 medium (BM) (può essere conservato a 4 °C per 4 settimane), BM con siero fetale al polpaccio 20% (FCS) (uso stesso giorno), BM con 0,12% proteinasi K (44 mAnson U/mg) soluzione (stesso uso quotidiano) e mezzo R16 completo con integratori (CM) come descritto da Romijn16 (può essere conservato a 4 °C per 3 settimane) (vedi tabelle S1, S2 e S3).</li>
	<li>Preriscaldare la soluzione di proteinasi K a 37 °C per attivarla e utilizzarla nel passaggio 2.5.</li>
</ol>2. Preparazione
<ol><li>Sacrificio rd1/WT animale nel giorno post-natale (P) 5 per decapitazione. Per gli animali di età superiore a P11, utilizzare CO2 e/o lussazione cervicale, secondo le normative locali sulla protezione degli animali.</li>
	<li>A seconda dell'età dell'animale, prima dell'enucleazione, se necessario, aprire i coperchi degli occhi usando le forcep e separare con molta attenzione i coperchi degli occhi, senza toccare o graffiare l'occhio sottostante.</li>
	<li>Enucleare rapidamente gli occhi sotto uno stereoscopio usando forcep curve.</li>
	<li>Incubare gli occhi in BM per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Incubare gli occhi in BM preriscaldato, con 0,12% proteinasi K a 37 °C per 15 min.</li>
	<li>Eseguire i seguenti passaggi all'interno di una cappa di flusso d'aria laminare per garantire condizioni sterili. Per inattivare la proteinasi K, trasferire gli occhi su BM contenente il 20% di FCS e incubare per 5 minuti presso RT.</li>
	<li>Sezionare gli occhi sotto uno stereoscopio, a livello aettico, in una piastra di Petri contenente BM fresco a RT. Avviare la dissezione il prima possibile dopo l'enucleazione. Più a lungo questa volta è, più difficile è sezionare la retina, gli occhi diventano molto morbidi.<ol>
<li>Con le forcep, tenere l'occhio dal nervo ottico. Usando forbici fini, fare una piccola incisione nella cornea creando 2 bordi da cui la cornea, il coroide e la sclera possono essere delicatamente sbucciati usando 2 paia di forcep fini(Figura 1 passi A-C). In alternativa, utilizzare una cannula a scartamento ridotto per fare una prima incisione nella cornea e quindi inserire una delle lame a forbice nell'apertura.</li>
		<li>Afferrare l'obiettivo con forcep fini. Posizionare una seconda coppia di forcep perpendicolarmente alle prime in modo che le prime forcep siano tra i 2 gambo del secondo. Tirare per estrarre l'obiettivo dalla tazza degli occhi. Se il corpo vitreo e il corpo ciliario sono ancora attaccati alla retina, rimuoverli con attenzione(Figura 1 fase D). NOTA: I passaggi 2.7.1 e 2.7.2 necessitano di pratica e garantiscono cautela per non danneggiare la retina.</li>
		<li>Tagliare la retina perpendicolarmente ai bordi in quattro punti, creando una forma a quadrifoglio(Figura 1 passaggi E-F).</li>
		<li>Utilizzando una pipetta con base ampiamente tagliata di una punta da 1 mL, tenere la retina in una goccia appesa di mezzo e trasferirla in un inserto filtrante per piatti di coltura posto in una piastra di coltura a 6 po porsi. Lo strato RPE deve essere fronte alla membrana(Figura 1 fase G).</li>
		<li>Utilizzando una pipetta, rimuovere con cura il mezzo in eccesso dall'inserto.</li>
		<li>Dai lati del pozzo, aggiungere 1 mL di CM per pozzo e incubare in un incubatore sterile a 37 °C con 5% CO2. Non immergere la retina nel mezzo in quanto ciò ridurrà l'ossigenazione e causerà la degenerazione tissutale. L'espianto deve rimanere all'interfaccia tra liquido e aria, coperto solo da un sottile film di liquido creato dalla tensione superficiale dell'acqua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lasciare indisturbato l'espianto retinale per le prime 48 ore per facilitare il recupero dopo la procedura di espianto.</li>
	<li>Cambiare il mezzo ogni secondo giorno (48 h). Scartare 700 μL di mezzo da ogni pozzo e aggiungere 900 μL di CM fresco al pozzo. In questo modo, la quantità di mezzo persa per evaporazione viene recuperata e l'espianto retinale mantiene alcuni dei fattori neuroprotettivi prodotti nelle precedenti 48 ore.</li>
	<li>Incubare il mezzo rimosso in un tubo di microcentrifugo separato e chiuso insieme alle colture per controllare e valutare la possibile contaminazione (cioè il cambiamento di colore del mezzo). NOTA: Le espianto retiniche possono essere conservate in coltura per almeno 2 settimane12.</li>
</ol>3. Dopo la ristrutturazione
NOTA: Gli espianto possono essere utilizzati per diverse applicazioni sperimentali (western blot, istologia, supporti interi, analisi genetica, elettrofisiologia). A seconda dell'applicazione, le espianto retiniche organotipiche possono essere congelate, litolate o preparate per la criosezione. I passaggi seguenti descrivono la preparazione istologica.
<ol><li>Eseguire una fissazione di 45 minuti con paraformaldeide al 4% (PFA), seguita da una crioprotezione graduale del saccarosio (10% di saccarosio per 10 minuti, 20% per 20 minuti e 30% per 2 ore a temperatura ambiente (RT) o durante la notte (ON) a 4 °C). Aggiungere questi buffer direttamente nel pozzo.</li>
	<li>Tagliare la membrana intorno alle espianto retiniche.</li>
	<li>Incorporare sia la membrana che il tessuto retinale nel mezzo per il tessuto congelato.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Figura 1: Procedura passo-passo per la preparazione di colture organotipiche di espianto retino. (A) Gli occhi del topo vengono enucleati e trasferiti in una soluzione di proteinasi K per consentire la separazione di sclera e coroide dalla retina e dall'RPE. Viene introdotto un piccolo taglio nello strato sclera / coroide. (B) Per sbucciare lo strato sclera/coroide vengono utilizzate due forcep. (C) Lo strato di coroide nero può essere visto durante il peeling. L'epitelio pigmentato retinico scuro (RPE) che sottolinea rimane attaccato al bulbo oculare. La sclera e la coroide vengono rimosse insieme al nervo ottico. (D) La lente e il vitreo vengono estratti con forcep.  Il corpo ciliario rimanente viene rimosso. (E) La retina mantiene una forma simile a una ciotola. (F) Per appiattire la retina per la coltivazione in un piatto, 4 tagli a uguale distanza intorno alla retina sono fatti con una forbice, dandogli una forma simile a un trifoglio. La coltura della retina viene trasferita in un inserto di coltura a membrana in una piastra a 6 po porsi con l'uso di una punta di pipetta da 1 mL tagliata. La retina conserva ancora parte della forma a ciotola. Tuttavia, dopo la rimozione del liquido in eccesso che circonda la retina, si svilupperà in una struttura planare. (G) Nella configurazione della membrana di coltura, la coltura della retina è appoggiata su una membrana porosa in policarbonato (PC) sopra una soluzione di mezzo R16 completo. Per garantire la vitalità, la coltura deve essere mantenuta in un incubatore sterile umidificato a 37 °C con 5% CO2e il mezzo deve essere sostituito ogni 48 ore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa cifra</a>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo presentato descrive colture organotipiche di estipe di retina di topo con RPE intatto in mezzo R16 definito, privo di siero e antibiotici. Questo protocollo è stato originariamente sviluppato a partire dalla fine degli anni '807,28 e da allora è stato continuamenteperfezionato 6,11,12. Tra le applicazioni degne di nota figurano studi sui meccanismi della degenerazione retinica ereditaria e l'identificazione dei farmaci retinoprotettivi23,29,30.
Per un esperimento riuscito, è necessario prendere in considerazione alcune considerazioni importanti. Ecco alcuni importanti punti di risoluzione dei problemi per migliorare la qualità delle culture. In primo luogo, le colture retiniche possono mostrare un'eccessiva piegatura e/o formazione di rosetta31. Ciò può essere causato toccando la retina con una forza durante la procedura di espianto. Inoltre, il corpo ciliario deve essere completamente rimosso dall'espianto, in quanto ciò può aumentare la piegatura retinica durante la coltura. In secondo luogo, durante il trasferimento della retina alla piastra del pozzo in una goccia sospesa, se la retina si affaccia sulla membrana il lato sbagliato verso il basso, tienila nella goccia appesa alla punta della pipetta e spingi molto delicatamente il mezzo in uscita dalla punta (senza staccare la goccia appesa) per capovolgere la retina. Infine, se l'RPE rimane attaccato alla sclera e si stacca dalla retina, è molto probabilmente causato da una predigestione insufficiente della sclera. Questo problema potrebbe essere particolarmente importante quando si lavora con gli occhi di animali più anziani o specie non roditori (ad esempio suini) e può essere risolto aumentando la concentrazione di proteinasi K.
Condurre colture organotipiche di espianto retiniche è una procedura complessa che richiede un'adeguata formazione ed esperienza. La mancanza di formazione può portare alla variabilità nella qualità delle espianto retiniche. Per questi motivi, è importante monitorare e verificare la fattibilità e la riproducibilità, caratterizzando, ad esempio, il tasso di morte cellulare con il saggio TUNEL. L'uso di un mezzo privo di antibiotici rende gli espianto retiniche vulnerabili alla contaminazione da batteri e funghi. Per ridurre al minimo questo rischio, si consiglia di prestare particolare attenzione a lavorare in condizioni veramente asettiche. Un'altra limitazione della coltura retinica in vitro sono le differenze nell'ambiente fisiochimico rispetto alla retina in vivo (ad esempio, apporto di sangue coroio e retinico, livelli di ossigeno e glucosio, pressione intraoculare, composizione del vitreo). Un sistema di perfusione continua, forse incorporato in un bioreattorededicato 32, potrebbe rendere questo modello più vicino alla condizione in vivo. Inoltre, l'assotomia del nervo ottico durante la dissezione retinica porterà alla morte delle cellule gangliari, che può indurre risposte allo stress8. Pertanto, è consigliabile lasciare che l'espianto sia lasciato ad adattarsi alle condizioni di coltura per almeno 2 giorni in vitro prima di essere sottoposto a una manipolazione o a un trattamento specifico.
Il metodo descritto viene solitamente eseguito su tessuti retinali immaturi, che possono sopravvivere bene per 4 settimane in vitro7,33. Tuttavia, la procedura è adattabile a una varietà di applicazioni, tra cui la ristrutturazione della retina adulta. Sebbene diversi approcci pubblicati descrivano l'isolamento della retina adulta senza il suo RPE34,35, l'incubazione con soluzione di papaina per un massimo di 1 h a 37 °C prima della dissezione consente all'RPE di rimanere attaccato alla retina anche se derivato da un topo adulto36.
Il mezzo privo di siero e l'ambiente in vitro definito chimicamente prevedono una manipolazione completamente definita e riproducibile delle condizioni sperimentali. Pertanto, le colture organotipiche di espianto retiniche sono strumenti preziosi nel campo dell'oftalmologia e delle neuroscienze e sono state utilizzate per lo studio delle malattie retiniche37,lo sviluppo della retina38,39,la terapia delle cellule staminali retiniche40,le modifichegenetiche 41e lo screening farmacologico. Come esempio specifico di test farmacologici, qui abbiamo usato colture di espianto retinale per testare un analogo cGMP (CN003), noto per ridurre la morte cellulare del fotorecettore nei modelli animali per la malattia retinicaereditaria 23 (Figura 3B). Un'altra possibile applicazione della tecnica è descritta nella figura 3C, che illustra come il controllo preciso dell'ambiente tissutale possa essere sfruttato per emulare le condizioni diabetiche24. A causa della conservazione dell'architettura tissutale durante l'intero periodo di coltura, le colture organotipiche di espianto retinico sono adatte anche per studi elettrofisiologici. La funzionalità neuronale sulle espianto retiniche è stata studiata utilizzando la registrazione patch-clamp42 e la registrazione multi-elettrodo-array (MEA)33,43. Quest'ultimo consente la registrazione dell'attività elettrica delle popolazioni neuronali allo stesso tempo ed è stato sfruttato per caratterizzare la funzionalità del fotorecettore e della cellula ganglionaria in condizioni di coltura. In una prospettiva più ampia, i sistemi di coltura organotipica delle espianto possono essere applicati anche nella ricerca pre-clinica, dove le colture di espianto sono state utilizzate per testare l'efficacia terapeutica dell'ipotermia44.
La tecnica di coltivazione organotipico delle espianto è relativamente semplice da eseguire e, rispetto ai corrispondenti esperimenti in vivo, è meno costosa e dispendiosa in termini di tempo ed evita le preoccupazioni etiche legate agli studi sugli animali vivi. Il controllo preciso sulle condizioni sperimentali e la conservazione della complessità dell'RPE e dei tessuti rendono il metodo uno strumento prezioso per migliorare le nostre conoscenze sulla fisiologia retinica e la fisiopatologia e consentire numerose applicazioni sperimentali.

Nella ricerca oftalmica, sono disponibili una varietà di modelli per studiare la retina, tra cui colture primarie di cellule retiniche, linee cellulari derivate dalla retina, organoidi retinali e modelli animali in vivo1,2,3,4,5. Tuttavia, ognuno di questi modelli soffre di svantaggi. Ad esempio, le cellule crescono in isolamento mentre la retina è una rete complessa con una moltitudine di interazioni cellula-cellula. Pertanto, è probabile che il comportamento delle colture cellulari isolate sia artificiale rispetto a quello osservato in un intero tessuto. Questo problema può essere in parte risolto utilizzando organoidi retinali differenziati in vitro, che possono essere utilizzati per studiare lo sviluppo e la biologia di base6. Tuttavia, ad oggi, la generazione organoide retinica richiede ancora molto tempo, richiede molto lavoro e soffre di problemi di riproducibilità, richiedendo un ulteriore lavoro di sviluppo sostanziale prima che gli organoidi possano essere utilizzati per la ricerca retinica traslizionale. Infine, gli studi sugli animali vivi, mentre probabilmente il modello più vicino alle esigenze della ricerca oftalmica, sono associati a forti preoccupazioni etiche. Un buon compromesso tra l'efficienza dei sistemi di coltura cellulare e la situazione reale dei modelli animali in vivo sono colture organotipiche di espianto retino. Tali colture riducono anche la sofferenza degli animali poiché non vengono eseguiti interventi in vivo.
Sono stati descritti diversi metodi per coltivare espianto retinale di diverse specie5,7,8. Il nostro protocollo descrive una tecnica per l'isolamento della neuroretina del topo insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE). Questa tecnica sarà adatta anche per colture retiniche di ratto9. La cultura della neuroretina insieme al suo RPE è di grande importanza per il successo. L'RPE svolge funzioni essenziali per la retina: trasporto di nutrienti, ioni, acqua, assorbimento della luce e protezione contro la fotoossidazione, reisomerazione dell'all-trans-retinica in 11-cis-retinica, che è fondamentale per il ciclo visivo, fagocitosi delle membrane fotorecettori a spargimento e secrezione di fattori essenziali per l'integrità strutturale della retina10. Il mantenimento dell'RPE consente uno sviluppo riuscito dei segmenti esterni ed interni del fotorecettore, mantenendo la retina vitale per un tempo più lungo11. La procedura descritta di seguito conserva le caratteristiche istotipiche e fisiologiche della retina per almeno due settimane12. Inoltre, coltivare le espianto retiniche organotipiche in mezzo privo di siero e privo di antibiotici evita la presenza di sostanze sconosciute e consente una semplice interpretazione dei risultati12.
Le colture organotipiche di espianto retino sono state essenziali per migliorare le nostre conoscenze sullo sviluppo retinale e sulla degenerazione7,13,14. Mostriamo qui che sono anche uno strumento utile per lo screening farmacologico e che possono essere utilizzati per modellare una varietà di malattie retiniche, compresa la retinopatia diabetica.

<table><tbody><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>(+/-)-&amp;alpha;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>CDP-Choline-Na</td><td>Sigma</td><td>30290</td><td></td></tr><tr><td>Corticosterone</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;times; 5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C8027</td><td></td></tr><tr><td>DL-Tocopherol</td><td>Sigma</td><td>T1539</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma</td><td>E0135</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&amp;micro;m</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3942.101</td><td>for Basal Medium</td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>L-CysteineHCl</td><td>Sigma</td><td>C7477</td><td></td></tr><tr><td>Linoleic Acid</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Linolenic Acid</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;x 4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>NaSeO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;x 5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td><td>F.S.T.</td><td>10360-13</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>21935025</td><td>44 mAnson U/mg</td></tr><tr><td>R16</td><td>Gibco</td><td>07491252A</td><td></td></tr><tr><td>Retinol</td><td>Sigma</td><td>R7632</td><td></td></tr><tr><td>Retinyl acetate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>F.S.T</td><td>15004-08</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filter 0.22&amp;micro;m</td><td>MILLEX GP</td><td>SLGP033RS</td><td>for supplements</td></tr><tr><td>T3&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Tocopherylacetate</td><td>Sigma</td><td>T1157</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td></td></tr><tr><td>Transwell permeable supports</td><td>Corning</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B1</td><td>Sigma</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin C</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

Nella ricerca oftalmica, c'è un forte bisogno di modelli in vitro della neuroretina. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la 150% organotipico della neuro retina deltopo con epitelio pigmentato retinico intatto (RPE). A seconda della domanda di ricerca, le retine possono essere isolate da animali di tipo selvatico o da modelli di malattia, per studiare, ad esempio, la retinopatia diabetica o la degenerazione retinica ereditaria. Gli occhi dei primi giorni postnatali 2-9 animali vengono enucleati in condizioni asettiche. Sono parzialmente digeriti nella proteinasi K per consentire un distacco del coroide dall'RPE. Sotto lo stereoscopio, una piccola incisione viene fatta nella cornea creando due bordi da cui la coroide e la sclera possono essere delicatamente staccate dall'RPE e dalla neuroretina. L'obiettivo viene quindi rimosso e l'oculare viene tagliato in quattro punti per dargli una forma a quattro spicchi simile a una foglia di trifoglio. Il tessuto viene infine trasferito in una goccia appesa in un inserto di coltura cellulare che tiene una membrana di coltura in policarbonato. Le colture vengono poi mantenute in mezzo R16, senza siero o antibiotici, in condizioni completamente definite, con un cambio medio ogni secondo giorno.
La procedura descritta consente l'isolamento della retina e la conservazione del suo normale contesto fisiologico e istotipico per periodi di coltivazione di almeno 2 settimane. Queste caratteristiche rendono le colture organotipiche di espianto retino un modello eccellente ad alto valore predittivo, per studi sullo sviluppo retinale, sui meccanismi delle malattie e sull'elettrofisiologia, consentendo allo stesso tempo lo screening farmacologico.

Dopo aver seguito il protocollo, le espianto retiniche sezionate e coltivate preservano la loro normale architettura tissutale, con strati distinti, dall'RPE allo strato cellulare ganglio (GCL), come mostrato nella figura 2. Le dimensioni dello strato nucleare esterno (ONL) e dello strato nucleare interno (INL) rimasero per lo più stabili per 2-3 settimane, con una perdita cellulare che progredisce lentamente e un graduale assottigliamento di questi strati che diventava sempre più evidente se il periodo di culto è prolungato a 4 settimane e oltre. Nel GCL, al contrario, a causa dell'assotomia del nervo ottico, un marcato assottigliamento si osserva di solito entro i primi 4 giorni dalla ristrutturazione. Successivamente, la popolazione di cellule rimanenti nel GCL (cellule di amacrina per lo più spostate) continuerà ad essere vitale per altre 3-4 settimane17,18,19.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Figura 2: Tipi di cellule presenti nelle impostazioni cultura delle piante esplant retiniche. Coltura di espianto retinale in P11 derivata da animali mutanti rd1 (A) e WT (B) che mostrano colorazione nucleare con cellule DAPI (sinistra, blu), fotorecettori di aste (al centro, rosso) e celle Müller (destra, verde). La colorazione nucleare evidenzia tutti i principali strati cellulari della retina come l'epitelio pigmentato retinico (RPE), lo strato nucleare esterno (ONL), lo strato nucleare interno (INL) e lo strato di cellule gangliari (GCL). Tipi di cellule specifiche negli strati nucleari, come aste e cellule di Müller, sono immunoetichettati rispettivamente con anticorpi alfa arrestin26 e glutammina synthetasi27. (C) Mostra la sezione a lunghezza intera di   un'intera retina del mouse rd1, con colorazione DAPI che evidenzia la coerenza, l'integrazione e lo sviluppo della retina. Queste retine sono state coltivate per 6 giorni. Descrizione della procedura: Retina e RPE derivati da animali rd1 o WT sono stati isolati a P5 e coltivati come descritto nel protocollo, fino a P11 con un cambiamento medio ogni 48 h. Le colture sono state fissate con il 4% di PFA a P11 e criosezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura</a>
Il mezzo privo di siero e l'ambiente in vitro sostenuto consentono di avere il pieno controllo sulle condizioni sperimentali. Qui, forniamo due esempi per applicazioni specifiche di questo protocollo. Il primo esempio illustra la possibilità di utilizzare espianto retinale per test antidroga o screening. Le colture organotipiche di espianto retiniche sono state preparate con modelli di mouse di tipo selvaggio (WT) e rd1. Quest'ultimo è un modello ben caratterizzato per la degenerazione retinica15. Nella retina del mouse rd1, la degenerazione ONL è innescata da livelli anormalmente elevati di cGMP nei fotorecettoridell'asta 6,20. L'eccessivo cGMP causa una maggiore attività dei canali ionici gated nucleotidici ciclici (CNGC) e della protein chinasi cGMP-dipendente (PKG), portando alla morte cellulare21. Il trattamento delle retine del topo rd1 con un analogo strutturale a cGMP (nucleotide ciclico #3; CN003), che si rivolge sia al PKG che al CNGC, è stato testato. Dopo l'espianto in P5, è stato seguito il paradigma di trattamento descritto nella figura 3A. Le colture di espianto sono state fissate con il 4% di PFA a P11 e preparate per la criosezione(figura 3A). Per valutare la morte cellulare di sezioni istologiche da campioni trattati, non trattati (NT) e WT, è stato eseguito un saggio terminale di deossinucleotidil transferasi dUTP nick end labeling (TUNEL)22. L'analisi delle cellule etichettate TUNEL ha mostrato un'alta percentuale di cellule morenti nell'ONL dei campioni non trattati rd1, mentre i fotorecettori del topo rd1 protetti cn003 se applicati a una concentrazione di 50 μM23 (Figura 3B).
Una frequente complicanza del diabete è la retinopatia diabetica, una malattia accecante che è difficile da riprodurre fedelmente nei modelli animali5. Il secondo esempio evidenzia l'uso di colture organotipiche di espianto retiniche per caratterizzare la vitalità cellulare retinica in condizioni che emulano il diabete mellito di tipo 2 (T2DM)24. Qui, abbiamo usato 20 mM dell'inibitore della glicolisi 2-deossi-glucosio (2-DG)25 e lo abbiamo somministrato al mezzo di coltura per 24 ore da P10 a P11. Mostriamo che sottosopporsi di espianto retiniche WT a tali condizioni diabetiche simulate in vitro porta a un'estesa morte cellulare neuronale della retina ( Figura3C). Questo paradigma a sua volta può quindi essere utilizzato, ad esempio, per studiare meccanismi degenerativi o per testare trattamenti retinoprotettivi in un contesto di diabete.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Figura 3: Due esempi per applicazioni dicolture organotipiche di escrezione retinica. (A) Descrizione della procedura: Retina e RPE derivati da animali rd1 o WT sono stati isolati nel giorno postnatale (P) 5 e coltivati come descritto sopra, con un cambiamento medio ogni 48 ore. A P7 e P9, il mezzo speso è stato scartato e alla piastra è stato aggiunto cm fresco contenente composto attivo ad una concentrazione di 50 μM. Le colture sono state fissate con il 4% di PFA a P11 e criosezione. (B) Prove composte sulla retina rd1. Le sezioni sono state ottenute da colture di escrezione retinica organotipiche WT, trattate (003) e non trattate (NT). Il saggio TUNEL (rosso) è stato usato come marcatore per la morte cellulare. Colorazione nucleare con DAPI (blu). La quantificazione mostrata nel grafico a barre illustra le percentuali di cellule morenti in condizioni WT, rd1 NT e rd1 003. Il trattamento con composto 003 ha ridotto significativamente la morte cellulare del fotorecettore rd1. (C) Simulazione del diabete mellito di tipo 2 (T2DM) sulla retina WT mediante trattamento con 2-deossic glucosio (2-DG). Il test TUNEL è stato eseguito su campioni NT e T2DM. La quantificazione indica un aumento molto significativo della morte cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura</a>
Tabella S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Clicca qui per scaricare la tabella</a>  
Tabella S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Clicca qui per scaricare la tabella</a>  
Tabella S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">Clicca qui per scaricare la tabella</a>

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Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Il protocollo descrive le espianto organotipiche della neuroretina deltopo,coltivate insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE), in mezzo definito R16, privo di siero e antibiotici. Questo metodo è relativamente semplice da eseguire, meno costoso e dispendioso in termini di tempo rispetto agli esperimenti in vivo, e può essere adattato a numerose applicazioni sperimentali.

Coltivazione a lungo termine e priva di siero di estipe di retina di topo organotipico con epitelio pigmentato retinico intatto

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

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Neuroscience

8.4K Views.  University of Tübingen. Il protocollo descrive le espianto organotipiche della neuroretina deltopo,coltivate insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE), in mezzo definito R16, privo di siero e antibiotici. Questo metodo è relativamente semplice da eseguire, meno costoso e dispendioso in termini di tempo rispetto agli esperimenti in vivo, e può essere adattato a numerose applicazioni sperimentali.

Video: Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental manipulations in ovo/in vivo makes the chicken embryonic retina a versatile and very efficient experimental model. Although the chicken retina is easy to target in ovo by intraocular injections or electroporation, the effective and exact concentration of the reagents within the retina may be difficult to fully control. This may be due to variations of the exact injection site, leakage from the eye or uneven diffusion of the substances. Furthermore, the frequency of malformations and mortality after invasive manipulations such as electroporation is rather high.
This protocol describes an ex ovo technique for culturing whole retinal explants from chicken embryos and provides a method for controlled exposure of the retina to reagents. The protocol describes how to dissect, experimentally manipulate, and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explants can be cultured for approximately 24 hr and be subjected to different manipulations such as electroporation. The major advantages are that the experiment is not dependent on the survival of the embryo and that the concentration of the introduced reagent can be varied and controlled in order to determine and optimize the effective concentration. Furthermore, the technique is rapid, cheap and together with its high experimental success rate, it ensures reproducible results. It should be emphasized that it serves as an excellent complement to experiments performed in ovo.

This protocol describes a method to dissect, experimentally manipulate and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explant cultures are useful when high success rate, efficacy and reproducibility are needed to test the effects of plasmids for electroporation and/or reagent substances, i.e., enzymatic inhibitors.

Espianti di retina intero da pollo embrioni per trattamenti di elettroporazione e Agenti chimici

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human retina and is therefore a valuable species for studying mechanisms of human retinal injury and degenerative disease. Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina isolated from eyes obtained from an abattoir. After removing the anterior segment, a trephine blade was used to create multiple neural retina-Bruch's membrane-RPE-choroid-sclera explants from the posterior segment of adult porcine eyes. A piece of sterile filter paper was used to lift the neural retina off from each explant. The filter paper-retina complex was cultured (photoreceptor side up) atop an insert, which was held away from the bottom of the culture dish by a custom-made stand. The stand allows for good circulation of the culture medium to both sides of the retina. Overall, this procedure is simple, reproducible, and permits preservation of native retinal structure for at least seven days, making it a useful model for a variety of morphological, pharmacological, and biochemical studies on mammalian retina.

Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina for seven days. Briefly, a sterile filter paper was used to lift the neural retina off from the RPE and place photoreceptor side up on an insert raised by a custom-made stand.

Cultura organotipica di tutto spessore Retina suina adulti

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Neuroscienze

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

In elettroporazione in vivo ed ex utero per l&#39;espressione genica in cellule gangliari della retina del mouse

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biologia

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Condizioni di coltura privo di alimentatore per i modelli di cellula retinica iPSC-derivato generazione umana e definito privo di Xeno

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Caratterizzazione di una nuova tecnica di coltura retinica organotipica umana

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Medicina

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent protein kinase (PKG) pathway in photoreceptor cells causes photoreceptor cell death, especially in models harboring phosphodiesterase 6b (PDE6b) mutations. Previous studies on RD have used mainly murine models such as rd1 or rd10 mice. Given the genetic and physiological differences between mice and humans, it is important to understand to which extent the retinas of primates and rodents are comparable. Macaques share a high level of genetic similarity with humans. Therefore, wild-type macaques (aged 1-3 years) were selected for the in vitro culture of retinal explants that included the retina-retinal pigment epithelium (RPE)-choroid complex. These explants were treated with different concentrations of the PDE6 inhibitor zaprinast to induce the cGMP-PKG signaling pathway and simulate RD pathogenesis. cGMP accumulation and cell death in primate retinal explants were subsequently verified using immunofluorescence and the TUNEL assay. The primate retinal model established in this study may serve for relevant and effective studies into the mechanisms of cGMP-PKG-dependent RD, as well as for the development of future treatment approaches.

Retinal explants obtained from wild-type macaques were cultured in vitro. Retinal degeneration and the cGMP-PKG signaling pathway was induced using the PDE6 inhibitor zaprinast. cGMP accumulation in the explants at different zaprinast concentrations was verified using immunofluorescence.

Colture organotipiche di espianti retinici da scimmia macaco

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

Espianto retinico della retina del topo adulto come modello ex vivo per lo studio delle malattie neurovascolari retiniche

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Caratterizzazione e dinamica morfologica di RPE murina primaria in coltura

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Autore in primo piano: Isolamento efficiente delle cellule epiteliali pigmentate primarie della retina da topi adulti per la ricerca sulla retinopatia

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Coltivazione a lungo termine e priva di siero di estipe di retina di topo organotipico con epitelio pigmentato retinico intatto

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Espianti di retina intero da pollo embrioni per trattamenti di elettroporazione e Agenti chimici

Cultura organotipica di tutto spessore Retina suina adulti

In elettroporazione in vivo ed ex utero per l'espressione genica in cellule gangliari della retina del mouse

Condizioni di coltura privo di alimentatore per i modelli di cellula retinica iPSC-derivato generazione umana e definito privo di Xeno

In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina

Caratterizzazione di una nuova tecnica di coltura retinica organotipica umana

Colture organotipiche di espianti retinici da scimmia macaco

Espianto retinico della retina del topo adulto come modello ex vivo per lo studio delle malattie neurovascolari retiniche

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti