Gli autori desiderano ringraziare E. de la Rosa e AI Valenciano di aiuto iniziale con l&#39;istituzione delle culture organotipica e U. Laub e U. Gerster per l&#39;assistenza tecnica.

Tutte le attrezzature ei reagenti devono essere acquistati sterile o ha bisogno di essere calore o vapore, sterilizzati o sterilizzati con il 70% ETOH. Gli autori affermano che gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Comunità europee direttiva del Consiglio (86/609/CEE), seguendo le linee guida del NIH per quanto riguarda la cura e l&#39;uso di animali nelle procedure sperimentali e le norme stabilite dalla Animal Istituzionale Cura e uso Comitato (IACUC) presso l&#39;Università di Duisburg-Essen (Germania). Parte 1: enucleazione degli occhi murino di differenti stadi di sviluppo Enucleazione degli occhi embrionale <ol><li> Accoppiamenti tempo in stato di gravidanza sono istituiti e la mattina del giorno in cui viene rilevato un plug vaginale in accoppiamento le femmine è designato 0 gestazione giorno. </li><li> La femmina gravida, è stato immolato per dislocazione cervicale quando lo sviluppo degli embrioni ha raggiunto il livello desiderato (qui: giorno embrionale (E) 15) e fissato su un bordo di cera 6. </li><li> La parete addominale è inumidito con il 70% ETOH, tagliare lungo la linea mediana e la lembi cutanei vengono fissati lateralmente da pin 6. </li><li> Il uterusses vengono rimossi con l&#39;addome, distaccato e trasferito in un bicchiere con PBS freddo 6. </li><li> Gli embrioni sono separati, trasferito in una piastra di Petri e la parete dell&#39;utero e delle membrane embrionali vengono rimossi con attenzione con l&#39;uso di forcipe 6. </li><li> Gli embrioni vengono uccisi per decapitazione. </li><li> Gli occhi sono enucleato essere l&#39;uso di multa, pinze curve, &quot;peeling&quot; gli occhi dalle orbite. </li></ol> Enucleazione degli occhi postnatale e adulta <ol start="1" type="1"><li> Cuccioli sono uccisi per decapitazione, cuccioli e adulti più anziani con dislocazione cervicale. </li><li> Fino alla fase post-natale P15, il punto di tempo in cui i topi aprire gli occhi, fessure degli occhi devono essere aperti meccanicamente con l&#39;uso di forcipe e ampliato da due tagli trasversali delle palpebre con le forbici a molla. </li><li> Gli occhi sono enucleato con l&#39;aiuto di pinze curve, applicando una pressione al orbita. </li></ol> Nota: Come al giorno postnatale 2, le ossa orbitali sono ancora cartilagineo, è importante non applicare troppa pressione durante il tentativo di rimuovere gli occhi. Al contrario, nei topi adulti, le ossa orbitali sono ferme. Pertanto, al fine di enucleare gli occhi è sufficiente esercitare una pressione l&#39;orbita senza allargare le fessure degli occhi in anticipo. Parte 2: dissezione di retine murini embrionali, postnatale e adulta Dissezione di retine <ol><li> Gli occhi sono posti in una piccola scatola di Petri con PBS sterile e gli strati occhio circostanti vengono rimossi al microscopio di dissezione. </li><li> Per rimuovere gli strati esterni dell&#39;occhio, nelle fasi post-natale e gli occhi degli adulti il ​​nervo ottico deve essere tagliato con l&#39;aiuto di forbici primavera o fuori pizzicato da pinze più vicino possibile alla base il più possibile. </li><li> Girare l&#39;occhio, in modo che la parte posteriore con il foro in cui il nervo ottico originariamente risiedeva ti sta di fronte. Inserisci nello spazio sottoretinico tra retina e dell&#39;epitelio pigmentato con la punta delle due pinze molto fine dal luogo in cui il nervo ottico penetrare gli strati dell&#39;occhio. Nota: Di solito, l&#39;epitelio pigmentato può essere facilmente identificato dal suo colore scuro. In alcuni ceppi di topi mutanti - soprattutto negli animali albini - questo strato di pigmento può tuttavia essere colorati e quindi non può essere facilmente rilevare. </li><li> Rimuovere l&#39;epitelio pigmentato con la membrana coroide attaccato e nella sclera con attenzione strappi su entrambi i lati con entrambe le pinze. </li><li> Staccare gli strati fino al livello della cornea, quindi girare l&#39;oculare verso l&#39;obiettivo e rimuovere la cornea con epitelio pigmentato, coroide membrana e nella sclera, tenendo la tazza rimanente della retina dal forcipe altri. </li><li> Afferrare il vitreo insieme alla piccola lente e mentre strappo con le pinze, tenere il wholemount retina in posizione con le pinze secondo. Nota: Quando la dissezione occhi embrionale, assicurarsi di rimuovere completamente il triangolare, tenda-come plesso capillare sotto il corpo vitreo con il vitreo. Nell&#39;occhio adulto, il vitreo va rilevato ai lati e la cura deve essere presa per non forare il vitreo con le punte della pinza, come il suo contenuto è viscoso e si attacca alla pinza, ostacolando la sua rimozione. </li><li> Per organotipica cultura wholemount le tazze della retina sono raccolti in una piastra da 96 pozzetti contenente 200 ul Dulbecco modificato aquila medio (vedi sotto). </li></ol> Nota: tra dissezione di retine individuale, mantenere la piastra a 96 pozzetti di raccolta contenente il terreno di coltura nell&#39;incubatore, come il pH del terreno di coltura è innescata da CO 2 attraverso il sistema carbonato. Parte 3: murini wholemount organotipica retinacultura <ol><li> Preparare 500 ml di cultura medio peso 7.8g Dulbecco modificato aquila / miscela di nutrienti F-12 HAM (DMEM) e 0,6 g NaHCO 3 e dissoluzione sia in acqua MiIliQ. Regolare il pH a 7.15. Aggiungi 50mg apo-transferin, 50μl putrescin (stock: 60mg/ml), 50μl di selenio (stock: 52μg/ml), il progesterone (stock: 60μg/ml), e 2,5 ml di gentamicina (200 mm) sotto il cofano. Mescolare e filtrare attraverso un filtro superiore bottiglia. Immediatamente prima dell&#39;uso aggiungere glutammina 10μl (200 mm) per mezzo di coltura ml. Nota: Questo terreno e siero-insulina-libero può essere conservato a 4 ° C per un massimo di 2 settimane e utilizzati per esperimenti di induzione dell&#39;apoptosi, come l&#39;insulina non contrasta gli effetti. Se incubazione di wholemounts per più di 24 ore è desiderato e tassi di morte cellulare non saranno valutate, siero insulina (es. siero fetale di vitello; FCS) o gli integratori dovrebbero essere aggiunti per migliorare i tassi di sopravvivenza. </li><li> Prima di iniziare la cultura, la wholemounts retina sono pre-incubate per 15 minuti a 37 ° C con 200 ul caldo, pH equilibrato DMEM contenente ialuronidasi 0.5mg/ml di pre-digerire la ialuronidasi contenenti interno ed esterno della membrana limitante della glia M ller cellule, facilitando la penetrazione di sostanze applicate esogena. </li><li> Retine sono trasferiti ad un 24-pozzetti con il minor numero possibile ialuronidasi e colto come wholemounts organotipica in 2ml chimica definita media Dulbecco modificato aquila. Nota: Per il trasferimento della retina, utilizzare una pipetta 1ml e tagliare la punta della pipetta di pochi millimetri per ampliare l&#39;apertura. Per gli occhi embrionale, da 200 microlitri puntale è sufficiente. I bordi di taglio dovrebbe essere dai lisci inserimento e torsioni di punta della pipetta secondo. Per 24-48 ore a breve termine le culture, tutte le misure possono essere eseguite al banco, ma se la contaminazione delle culture si rivela essere un problema, si dovrebbe lavorare sotto il cofano. </li><li> Le culture sono mantenuti per 24 - 48 ore a 37 ° C in un 5% di CO 2 nell&#39;atmosfera e ad esempio, sottoposti a trattamento farmacologico con fattori ricombinanti. </li></ol> Parte 4: dissociazione di coltura wholemounts retina <ol><li> Dopo il tempo desiderato cultura, retina sono raccolti in provette Eppendorf da 2 ml a fondo rotondo contenente 850 microlitri di PBS e 50 microlitri di siero albumina bovina (BSA; 30 mg / ml). </li><li> Luogo provette Eppendorf con retine in un blocco di riscaldamento, riscaldato a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 25 microlitri collagenasi (200 U / ml) e 25 microlitri ialuronidasi (20mg/ml) a ciascuna provetta Eppendorf e iniziare a dissociare la retina in sospensione singola cella da 3 passa attraverso una pipetta Pasteur siliconata. </li><li> Tripsina aggiungere 10 microlitri (1mg/ml), attendere per 3-5 minuti, e poi lentamente pipetta 3-5 volte su e giù con siliconato pipetta Pasteur di dissociarsi meccanicamente i tessuti. </li><li> Aggiungere 10 microlitri DNasi I (5mg/ml), ancora una volta attendere per 3-5 minuti, poi lentamente pipetta 3-5 volte su e giù con siliconata pipetta Pasteur. Nota: Il tempo di incubazione per la dissociazione enzimatica varia e dipende dalla dimensione degli occhi e la fase di sviluppo, rispettivamente. Controllare la fase di digestione enzimatica del tessuto pipettando gentilmente su e giù. </li><li> Se la sospensione cellulare non è omogenea ormai, ma contiene ancora aggregati di cellule grandi, aggiungere altri 10 microlitri tripsina e 10 microlitri DNasi I. </li><li> Quando la sospensione cellulare è omogeneo, la digestione del tessuto viene fermato con l&#39;aggiunta di 10 microlitri EDTA (0,5 M), tubi Eppendorf vengono rimossi dalla stufa e le sospensioni cellulari sono fissati per 1h aggiungendo 1 ml fresca, paraformaldeide ghiacciata 8% (PFA) a temperatura ambiente su una rotazione shaker. </li></ol> Parte 5: Lavaggio delle sospensioni cellulari dissociato <ol><li> La sospensione cellulare viene centrifugato per 5 minuti a 4 ° C e 0,2 rcf in una centrifuga di raffreddamento. </li><li> Il supernatante viene scartato e il pellet viene risospeso in 1ml PBS contenente BSA 3mg/ml. </li><li> Dopo aver ripetuto queste fasi di lavaggio due volte, il pellet viene infine risospeso in 500 microlitri di PBS contenente BSA 3mg/ml, 5mm EDTA e sodio azide allo 0,1%. </li></ol> Nota: L&#39;aggiunta di acido di sodio consentire l&#39;archiviazione di sospensione cellulare per diversi giorni a 4 ° C. Tuttavia, se una colorazione immunocitochimica seguirà, non aggiungere l&#39;acido di sodio al buffer di risospensione, come questo si traduce in perdita di qualità colorazione. Parte 6: Cytospin di sospensioni cellulari per l&#39;apoptosi e l&#39;analisi quantitativa proliferazione <ol><li> Un satinato-end vetrino da microscopio, un filtro cytospin con uno o due fori e un imbuto cytospin vengono inseriti in una clip scivolo cytospin. La clip scorrevole è chiuso e posizionato nel rotore cytospin. </li><li> La sospensione cellulare dissociato è omogeneizzato pipettando gentilmente su e giù. Nota: A seconda della fase di sviluppo della retina, la sospensione cellulare dalla procedura di dissociazione potrebbe essere necessarioessere diluito con PBS per ottenere un numero numerabile di cellule. </li><li> Un&#39;aliquota (100 l), della sospensione cellulare viene applicata a un imbuto cytospin. Nota: Quando pipettaggio la sospensione cellulare per l&#39;imbuto, la punta della pipetta dovrebbe raggiungere tutta la strada fino al fondo dell&#39;imbuto. E &#39;importante non far passare il punto di pressione secondo pipetta in quanto ciò crea bolle d&#39;aria, che sarà visibile nel punto cella dopo la cytospin e ostacola conta delle cellule. </li><li> La sospensione cellulare è depositata su un vetrino a 700 rpm per 7 min. </li><li> Per la determinazione degli effetti di fattori esogeni applicata sui livelli di apoptosi cellule possono essere colorate con 4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 2μg/ml), montato con fluorescente mezzo di montaggio. Cambiamenti nella apoptosi delle cellule può essere determinata contando almeno 1000 cellule (di cui almeno 10 nuclei pycnotic) in punti cella cytospin e il tasso di morte cellulare è calcolato come percentuale di cellule totale conta 3,4. Nota: in alternativa, la distribuzione dei nuclei apoptotici possono essere valutati in flatmounts 3 o criostato sections4 di colture di wholemounts retina da TdT-mediata fine etichettatura dUTP nick (TUNEL). </li><li> Per il rilevamento della proliferazione delle cellule, BrdU (5 mM) possono essere aggiunte 6 ore prima della fine della cultura e della incorporazione di BrdU visualizzate in cytospins di omogenati cella colorazione immunocitochimica con un anticorpo anti-BrdU (ad esempio Developmental Studies Ibridoma Banca, Iowa, USA). </li><li> L&#39;effetto del trattamento su diversi tipi di cellule della retina possono essere visualizzati in cytospins da anticorpi specifici come Brn3a neuroni (cellule gangliari marker) o opsina (fotorecettori marcatore) e di contrasto con DAPI. </li></ol> Parte 7: Risultati Rappresentante <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figura 1" /> Figura 1: Passi in preparazione della murino wholemounts organotipica retina Una testa di topo con entrambi gli occhi. B occhio murini con il lato alto lente, tutti i livelli ancora al suo posto. Dell&#39;occhio C murini da parte posteriore con il nervo ottico ancora attaccato. Occhio D murini con sclera e dell&#39;epitelio pigmentato parzialmente rimosso. E retina murini con epitelio della cornea, sclera e pigmento completamente rimossa, ma lenti e vitreo ancora al loro posto. F murini tazza retina wholemount con obiettivo e vitreo rimosso. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1634/1634fig2tmb.jpg" border="0" alt="Figura 2" /> Figura 2: Analisi delle culture organotipica retina wholemount da cytospin e sezioni Per l&#39;analisi di apoptosi, cytospins di sospensioni cellulari dissociate sono macchiati dal DAPI e nuclei pycnotic possono essere distinte dalla frammentazione nucleare o condensazione della cromatina (punte di freccia in A). In alternativa, sezioni wholemount (CE; giorni retina murina postnatale (P) 2) o flatmount retina (F) può essere sottoposto a un test TUNEL e di contrasto con DAPI (E). L&#39;effetto del trattamento su diversi tipi di cellule della retina possono essere visualizzati in cytospins neurone da anticorpi specifici come la cellula gangliare marcatore Brn3a (frecce in B) GCL, strato di cellule gangliari;. INL, prospettico strato interno nucleare. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1634/1634fig2.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2.

<ol>
	<li>Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+reconstruction+in+3D-spheroids+from+rodent+retina+in+a+motion-free,+bioreactor-based+microstructure.">Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure.</a> Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Balance+of+pro-apoptotic+transforming+growth+factor-beta+and+anti-apoptotic+insulin+effects+in+the+control+of+cell+death+in+the+postnatal+mouse+retina.">Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).</li><li>Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factors+beta+and+Bone+morphogenetic+proteins:+Cooperative+players+in+chick+and+murine+programmed+retinal+cell+death.">Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death.</a> J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).</li><li>de la Rosa, E. J., D&#237;az, B., De Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoculture+of+the+chick+embryonic+neuroretina.">Organoculture of the chick embryonic neuroretina.</a> Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).</li><li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay:+How+it+really+works.">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works.</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li></ol>

Il vantaggio di murine organotipica retina 2-5 wholemount culture più di dissociazione, monostrato, culture 3D retinospheroid o ri-aggregati sferoidali 1 risiede nella conservazione delle interazioni e connessioni neuronali, imitando la situazione in vivo. Rispetto ai rapporti precedenti 2, il nostro articolo video fornisce una dimostrazione dettagliata delle peculiarità di enucleazione degli occhi murini e la dissezione di retine di varie fasi di sviluppo tra cui la rimozione...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mice</td>
<td>Animal</td>
<td>Charles Rivers Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection microscope</td>
<td>Tool</td>
<td>ZEISS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PBS should be cold (&gt; 4&deg;C) and sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 8900</td>
<td>DMEM / F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Apo-transferin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T 1147</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Putrescin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 5780</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium selenite</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>S 9133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Progesterone</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P 6149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-024</td>
<td>200 mM (100X), liquid</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine serum albumine (BSA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roth</td>
<td>8076.3</td>
<td>30 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C 0773</td>
<td>200 U/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4799</td>
<td>From porcine pancreas; 1 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H 3884</td>
<td>200 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>1 284 932</td>
<td>10 mg/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>E 6511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Serva</td>
<td>35130</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).</td>
</tr>
<tr>
<td>4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D 0542</td>
<td>DAPI</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dako</td>
<td>S3023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BrDU</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>B 9285</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24-well plates</td>
<td>Tool</td>
<td>FALCON</td>
<td>3047</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>Tool</td>
<td>Brand</td>
<td>747720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #5</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Forceps DUMONT #7</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11271-30</td>
<td>curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)</td>
</tr>
<tr>
<td>Spring scissors,straight, 8cm</td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>fine, small straight blades</td>
</tr>
<tr>
<td>Standard scissors, straight, sharp/blunt </td>
<td>Tool</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>14007-14</td>
<td>Use for decapitation or cervical dislocation</td>
</tr>
<tr>
<td>Eppendorf tubes</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin</td>
</tr>
<tr>
<td>Cooling centrifuge</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotation shaker</td>
<td>Tool</td>
<td>CAT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytospin</td>
<td>Tool</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture

Ablazioni mirata di geni e l&#39;analisi di modelli animali è la strategia classica per la funzione dell&#39;iscrizione gene specifico della retina. Tuttavia, transgenici, retina specifici o condizionale modelli di topo knockout spesso mostrano mortalità precoce o soffre di malformazioni gravi, impedendo l&#39;analisi al di là fasi embrionali o postnatale precoce. Colture di cellule primarie è un&#39;alternativa per studiare gli effetti di fattori applicata ricombinante esogena, l&#39;iperespressione di geni o di siRNA-mediato knockdown gene in un ambiente controllato. Colture di cellule dissociate ha il vantaggio che i segnali endogeni raggiungere le cellule bersaglio sono ridotte, facilitando l&#39;identificazione di effetti esogenamente attivato dopo manipolazione farmacologica. Tuttavia, importanti interazioni cellula-cellula sono inizialmente distrutte per digestione enzimatica o dissociazione meccanica, anche se le culture retinospheroid riaggregati 1 sono utilizzati. Al contrario, organotipica culture retina wholemount fornire un sistema vicino al fisiologico in situazione vivo con le interazioni e le connessioni neuronali 2-5 ancora conservati. In questo articolo abbiamo video di fornire una dimostrazione passo passo (1) l&#39;istituzione di in vivo, come organotipica culture wholemount della retina, comprese particolarità dissezione degli occhi murini embrionale, postnatale e adulta e (2) una procedura di dissociazione e cytospin per l&#39;analisi dei neuroni apoptosi e la proliferazione delle cellule della retina in wholemounts organotipica, ad esempio dopo coltura in presenza di fattori esogeni applicata ricombinante.

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In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

In questo articolo video dimostra la creazione di organotipica culture retina wholemount cytospin e una procedura per l&#39;analisi di esogenamente effetti indotti. Organotipica culture retina wholemount imitare il<em&gt; In vivo</em&gt; Situazione e favorire in modo significativo l&#39;accessibilità di retina murini per le manipolazioni sperimentali che aggirano gli svantaggi dei classici modelli animali murini.

In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

in-vivo-like-organotypic-murine-retinal-wholemount-culture

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

17.7K Views.  University of Duisburg-Essen. In questo articolo video dimostra la creazione di organotipica culture retina wholemount cytospin e una procedura per l'analisi di esogenamente effetti indotti. Organotipica culture retina wholemount imitare il In vivo Situazione e favorire in modo significativo l'accessibilità di retina murini per le manipolazioni sperimentali che aggirano gli svantaggi dei classici modelli animali murini.

Video: In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Organotypic Culture of Adult Rabbit Retina

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with imaging techniques, genetic manipulation, and electrophysiological recording. Here we present a simple interphase tissue culture system for adult rabbit retina that requires no specialized equipment and very little maintenance. We demonstrate the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells. Rabbit retinas cultured this way can be kept alive for up to 6 days with very little changes of the overall anatomical structure or the morphology of individual ganglion- and amacrine cells.

This article demonstrates the dissection and incubation of rabbit retina and particle-mediated gene transfer of plasmids encoding GFP or a variety of subcellular markers into retinal ganglion cells.

Cultura organotipica di Retina Coniglio adulti

Organotypic culture systems of functional neural tissues are important tools in neurobiological research. Ideally, such a system should be compatible with ...

Ricerca

Biologia

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

Slice Cultura organotipica di E18 cervello dei topi

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

A cellula intera Recordings of Light Evocati eccitatorio Correnti Synaptic nel Slice Retinal

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective imaging of fluorescent molecules that are closest to a high refractive index substance such as glass1. In this article, we apply this technique to image exocytosis of synaptic vesicles in retinal bipolar cells isolated from the goldfish retina. These neurons are very suitable for this kind of study due to their large axon terminals. By simultaneously patch clamping the bipolar cells, it is possible to investigate the relationship between pre-synaptic voltage and synaptic release2,3. Synaptic vesicles inside the bipolar cell terminals are loaded with a fluorescent dye (FM 1-43&reg;) by co-puffing the dye and a ringer solution containing a high K+ concentration onto the synaptic terminals. This depolarizes the cells and stimulates endocytosis and consequent dye uptake into the glutamatergic vesicles. After washing the excess dye away for around 30 minutes, cells are ready for being patch clamped and imaged simultaneously with a 488 nm laser. The patch pipette solution contains a rhodamine-based peptide that binds selectively to the synaptic ribbon protein RIBEYE4, thereby labeling ribbons specifically when terminals are imaged with a 561 nm laser. This allows the precise localization of active zones and the separation of synaptic from extra-synaptic events.

In this video, we demonstrate how to label and visualize single synaptic vesicle exocytosis and trafficking in goldfish retinal bipolar cells using total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy.

Esocitosi imaging in cellule bipolari della retina con microscopia TIRF

Total internal reflectance fluorescence (TIRF) microscopy is a technique that allows the study of events happening at the cell membrane, by selective ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while maintaining transparency of the visual axis. Perturbations to this delicate balance cause blinding illnesses, such as diabetic retinopathy. Therefore, the understanding of energy metabolism changes in the retina during disease is imperative to the development of rational therapies for various causes of vison loss. The recent advent of commercially-available extracellular flux analyzers has made the study of retinal energy metabolism more accessible. This protocol describes the use of such an analyzer to measure contributions to retinal energy supply through its two principle arms - oxidative phosphorylation and glycolysis - by quantifying changes in oxygen consumption rates (OCR) and extracellular acidification rates (ECAR) as proxies for these pathways. This technique is readily performed in explanted retinal tissue, facilitating assessment of responses to multiple pharmacologic agents in a single experiment. Metabolic signatures in retinas from animals lacking rod photoreceptor signaling are compared to wild-type controls using this method. A major limitation in this technique is the lack of ability to discriminate between light-adapted and dark-adapted energy utilization, an important physiologic consideration in retinal tissue.

This technique describes real time recording of oxygen consumption and extracellular acidification rates in explanted mouse retinal tissues using an extracellular flux analyzer.

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Coltura primaria di cellule epiteliali pigmentate retiniche suine

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...