Este trabalho de pesquisa recebeu apoio financeiro da União Europeia (transMed; H2020-MSCA-765441), o conselho de pesquisa alemão (DFG; PA1751/8-1, 10-1) e o conselho de bolsas da China.

Os protocolos animais em conformidade com o §4º da lei alemã de proteção animal foram revisados e aprovados pelo Comitê de Proteção Animal da Universidade de Tübingen (Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; Registro Nº. AK02/19M). Neste estudo, as retinas foram obtidas a partir de camundongos do tipo selvagem (WT) e rd1, sendo este último um modelo bem caracterizado para degeneração da retina hereditária15. Os camundongos estavam alojados sob iluminação cíclica branca padrão, tinham livre acesso a alimentos e água, e eram usados independentemente do sexo.
1. Lista de verificação
<ol><li>Para garantir condições estéreis e evitar contaminações, limpe e desinfete a capa de fluxo de ar laminar com 70% de etanol. Certifique-se de deixar o etanol evaporar completamente, para evitar a intoxicação das culturas da retina.</li>
	<li>Ferramentas de autoclave (por exemplo, tesoura, fórceps e colher de raspagem de microscópio oftálmico) antes de usar.</li>
	<li>Prepare as seguintes mídias com antecedência sob uma coifa de fluxo laminar, sob condições estéreis: meio Basal R16 (BM) (pode ser armazenado a 4 °C por 4 semanas), BM com soro de bezerro fetal de 20% (FCS) (uso do mesmo dia), BM com 4 °C 0,12% proteinase K (44 mAnson U/mg) solução (uso do mesmo dia) e meio R16 completo com suplementos (CM) como descrito por Romijn16 (pode ser armazenado a 4 °C por 3 semanas) (ver Tabelas S1, S2 e S3).</li>
	<li>Pré-aqueça a solução proteinase K a 37 °C para ativá-la e usá-la na etapa 2.5.</li>
</ol>2. Preparação
<ol><li>Sacrifício do animal rd1/WT no dia pós-natal (P) 5 por decapitação. Para animais com idade inferior a P11, utilize CO2 e/ou luxação cervical, de acordo com as normas locais de proteção animal.</li>
	<li>Dependendo da idade do animal, antes da enucleação, se necessário, abra as pálpebras dos olhos usando fórceps e separe cuidadosamente as pálpebras, sem tocar ou coçar o olho abaixo.</li>
	<li>Enuclear rapidamente os olhos sob um estereóscópio usando fórceps curvas.</li>
	<li>Incubar os olhos em BM por 5 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Incubar os olhos em BM pré-aquecido, com 0,12% de proteinase K a 37 °C por 15 min.</li>
	<li>Realize as seguintes etapas dentro de uma coifa de fluxo de ar laminar para garantir condições estéreis. Para inativar proteinase K, transfira os olhos para BM contendo 20% de FCS e incubar por 5 min na RT.</li>
	<li>Disseca os olhos sob um estereóscópio, asepticamente, em uma placa de Petri contendo BM fresco na RT. Inicie a dissecção o mais rápido possível após a enucleação. Quanto mais tempo este tempo é, mais difícil é dissecar a retina, os olhos ficando muito macios.<ol>
<li>Com fórceps, segure o olho do nervo óptico. Usando uma tesoura fina, faça uma pequena incisão na córnea criando 2 bordas de onde a córnea, o coroide e a esclera podem ser delicadamente descascados usando 2 pares de fórceps finos(Figura 1 passos A-C). Alternativamente, use uma cânula de bitola estreita para fazer uma primeira incisão na córnea e, em seguida, inserir uma das lâminas da tesoura na abertura.</li>
		<li>Segure a lente com fórceps finos. Coloque um segundo par de fórceps perpendicularmente para os primeiros para que os primeiros fórceps estejam entre as 2 hastes do segundo. Puxe para extrair a lente do copo dos olhos. Se o vítreo e o corpo ciliar ainda estiverem presos à retina, remova-os cuidadosamente(Figura 1 passo D). NOTA: As etapas 2.7.1 e 2.7.2 precisam de prática e garantir cautela para não danificar a retina.</li>
		<li>Corte a retina perpendicular às suas bordas em quatro pontos, criando uma forma de trevo de quatro folhas(Figura 1 passos E-F).</li>
		<li>Usando uma pipeta com base amplamente cortada de uma ponta de 1 mL, segure a retina em uma gota de meio e transfira-a para uma inserção de filtro de prato de cultura colocada em uma placa de cultura de 6 poços. A camada RPE deve enfrentar a membrana (Figura 1 passo G).</li>
		<li>Com uma pipeta, remova cuidadosamente o excesso de meio da inserção.</li>
		<li>Dos lados do poço, adicione 1 mL de CM por poço e incuba em uma incubadora estéril a 37 °C com 5% de CO2. Não submergir a retina no meio, pois isso reduzirá a oxigenação e causará degeneração tecidual. A explanta deve permanecer na interface entre líquido e ar, coberta apenas por uma fina película de líquido criada pela tensão superficial da água.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deixe a explantização da retina intacta durante as primeiras 48 horas para facilitar a recuperação após o procedimento de explantação.</li>
	<li>Mude o meio a cada dois dias (48 h). Descarte 700 μL de meio de cada poço e adicione 900 μL de CM fresco ao poço. Dessa forma, a quantidade de médio perdido pela evaporação é recuperada e a explanta da retina mantém alguns dos fatores neuroprotetores produzidos nas 48 h anteriores.</li>
	<li>Incubar o meio removido em um tubo de microcentrifuge separado e fechado, juntamente com as culturas para controlar e avaliar possíveis contaminações (ou seja, mudança de cor do meio). NOTA: As explantas de retina podem ser mantidas na cultura por pelo menos 2 semanas12.</li>
</ol>3. Após a colheita
NOTA: Explantas podem ser usadas para diferentes aplicações experimentais (mancha ocidental, histologia, montagens inteiras, análise genética, eletrofisiologia). Dependendo da aplicação, as explanações organotípicas da retina podem ser congeladas, diluidas ou preparadas para a crioseção. Os passos abaixo descrevem a preparação histológica.
<ol><li>Realize uma fixação de 45 min com 4% de paraformaldeído (PFA), seguido de crioproteção gradual de sacarose (10% de sacarose por 10 min, 20% para 20 min e 30% para 2h em temperatura ambiente (RT) ou durante a noite (ON) a 4 °C). Adicione esses buffers diretamente no poço.</li>
	<li>Corte a membrana ao redor das explantas da retina.</li>
	<li>Incorpore a membrana e o tecido da retina no meio para tecido congelado.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Figura 1: Procedimento passo a passo para a preparação de culturas organotípicas de explant retina. (A) Os olhos do rato são enucleados e transferidos para uma solução de proteinase K para permitir a separação de esclera e coroide da retina e RPE. Um pequeno corte na camada esclera/coroide é introduzido. (B) Dois fórceps são usados para descascar a camada esclera/coroide. (C) A camada coroide preta pode ser vista durante o peeling. O epitélio de pigmento de retina escura sublinhado (RPE) permanece preso ao globo ocular. A esclera e o coroide são removidos junto com o nervo óptico. (D) A lente e o vítreo são extraídos com fórceps.  O corpo ciliar restante é removido. (E) A retina mantém uma forma semelhante a uma tigela. (F) Para achatar a retina para a colheita em um prato, 4 cortes em igual distância ao redor da retina são feitos com uma tesoura, dando-lhe uma forma de trevo. A cultura da retina é transferida para uma inserção de cultura de membrana em uma placa de 6 poços com o uso de uma ponta de pipeta de 1 mL cortada. A retina ainda retém um pouco da forma da tigela. No entanto, após a remoção do excesso de líquido ao redor da retina, ele se desdobrará para uma estrutura planar. (G) Na configuração da membrana de cultura, a cultura da retina está repousando sobre uma membrana porosa de policarbonato (PC) em cima de uma solução de meio R16 completo. Para garantir a viabilidade, a cultura deve ser mantida em uma incubadora estéril umidificada a 37 °C com 5% de CO2, e o meio deve ser substituído a cada 48 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura</a>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo apresentado descreve culturas organotípicas de explantagem organotípica de retina de camundongos com RPE intacto em meio R16 definido, livre de soro e antibióticos. Este protocolo foi originalmente desenvolvido a partir do final da década de 19807,28 e desde então tem sido continuamente refinado6,11,12. Aplicações notáveis incluem estudos sobre os mecanismos de degeneração da retina hereditária e a identificação de medicamentos retinoprotetores23,29,30.
Para um experimento bem-sucedido, algumas considerações importantes precisam ser levadas em conta. Aqui estão alguns pontos importantes de solução de problemas para ajudar a melhorar a qualidade das culturas. Em primeiro lugar, as culturas da retina podem apresentar dobramento excessivo e/ou formação de roseta31. Isso pode ser causado por tocar a retina com um fórceps durante o procedimento de explantação. Além disso, o corpo ciliar deve ser completamente removido da explanta, pois isso pode aumentar a dobra da retina durante a cultura. Em segundo lugar, durante a transferência da retina para a placa do poço em uma gota pendurada, se a retina enfrentar a membrana do lado errado para baixo, mantenha-a na gota pendurada na ponta da pipeta e empurre suavemente o meio para dentro e para fora da ponta (sem desprender a gota de suspensão) para virar a retina ao redor. Finalmente, se o RPE permanecer ligado à esclera e se desprender da retina, é provavelmente causado por uma predigesção insuficiente da esclera. Esse problema pode ser especialmente importante quando se trabalha com olhos de animais mais velhos ou espécies não-roedores (por exemplo, porcos) e pode ser resolvido aumentando a concentração de proteínas.
A realização de culturas organotípicas de explant retina é um procedimento complexo que requer treinamento e experiência adequados. A falta de treinamento pode levar à variabilidade na qualidade das explantas da retina. Por essas razões, é importante monitorar e verificar a viabilidade e a reprodutibilidade, caracterizando, por exemplo, a taxa de morte celular com o ensaio TUNEL. O uso de um meio livre de antibióticos torna as explantas da retina vulneráveis à contaminação por bactérias e fungos. Para minimizar esse risco, recomendamos que se seja tomado um cuidado especial para trabalhar em condições verdadeiramente assépticas. Outra limitação da cultura in vitro da retina são as diferenças no ambiente fisioquímico quando comparadas com a retina in vivo (por exemplo, fonte sanguínea choroidal e retina, níveis de oxigênio e glicose, pressão intraocular, composição do vítreo). Um sistema contínuo de perfusão, talvez incorporado em um bioreatordedicado 32 poderia tornar este modelo mais próximo da condição in vivo. Além disso, a axotomia do nervo óptico durante a dissecção da retina levará à morte celular de gânglio, que pode induzir respostas ao estresse8. Portanto, é recomendável que a explanta seja deixada para se adaptar às condições de cultivo por pelo menos 2 dias in vitro antes de ser submetida a uma manipulação ou tratamento específico.
O método descrito é geralmente realizado em tecidos imaturos da retina, que podem sobreviver bem por 4 semanas in vitro7,33. No entanto, o procedimento é adaptado para uma variedade de aplicações, incluindo a cultura de retina adulta. Embora diferentes abordagens publicadas descrevam o isolamento da retina adulta sem seu RPE34,35, a incubação com solução de papain por até 1 h a 37 °C antes da dissecção permite que o RPE fique preso à retina mesmo quando derivado de um rato adulto36.
O meio sem soro e o ambiente in vitro quimicamente definido proporcionam uma manipulação totalmente definida e reprodutível das condições experimentais. Portanto, as culturas organotípicas de explantização da retina são ferramentas valiosas no campo da oftalmologia e neurociência, e têm sido utilizadas para estudar doenças da retina37,desenvolvimento da retina38,39,terapia de células-tronco da retina40,modificações genéticas41e triagem farmacológica. Como exemplo específico de teste de drogas, aqui usamos culturas de explant da retina para testar um análogo cGMP (CN003), conhecido por reduzir a morte celular fotorreceptora em modelos animais para doença de retina hereditária23 (Figura 3B). Outra possível aplicação da técnica é descrita na Figura 3C,que ilustra como o controle preciso do ambiente tecidual pode ser explorado para emular condições diabéticas24. Devido à preservação da arquitetura tecidual durante todo o período de cultivo, as culturas organotípicas de explant da retina também são adequadas para estudos eletrofisiológicos. A funcionalidade neuronal em explantas de retina tem sido investigada usando a gravação de patch-clamp42 e multi-eletrodo-array (MEA) gravando33,43. Este último permite o registro da atividade elétrica das populações neuronais ao mesmo tempo e tem sido explorado para caracterizar a funcionalidade de células fotorreceptoras e gânglios em condições culturais. Em uma perspectiva mais ampla, os sistemas organotípicos de cultura explant também podem ser aplicados em pesquisas pré-clínicas, onde culturas de explant foram utilizadas para testar a eficácia terapêutica da hipotermia44.
A técnica de cultivo de plantas organotípicas é relativamente simples de realizar e, quando comparada aos experimentos in vivo correspondentes, é menos cara e demorada, e evita as preocupações éticas relacionadas aos estudos em animais vivos. O controle preciso sobre as condições experimentais e a preservação da RPE e da complexidade tecidual fazem do método uma ferramenta valiosa para melhorar nosso conhecimento sobre fisiologia da retina e fisiopatologia e possibilitar inúmeras aplicações experimentais.

Em pesquisas oftálmicas, uma variedade de modelos estão disponíveis para estudar a retina, incluindo culturas primárias de células da retina, linhas celulares derivadas da retina, organoides de retina e modelos in vivo animais1,2,3,4,5. No entanto, cada um desses modelos sofre de desvantagens. Por exemplo, as células crescem isoladamente enquanto a retina é uma rede complexa com uma infinidade de interações célula-célula. Assim, o comportamento das culturas celulares isoladas é provável que seja artificial em comparação com o observado em todo um tecido. Esse problema pode, em parte, ser remediado usando organoides in vitro diferenciados da retina, que podem ser usados para estudar o desenvolvimento e a biologia básica6. No entanto, a partir de hoje, a geração organoide da retina ainda é demorada, intensiva em mão-de-obra, e sofre de problemas de reprodutibilidade, exigindo um trabalho substancial de desenvolvimento antes que os organoides possam ser usados para pesquisas translacionais da retina. Finalmente, estudos sobre animais vivos, embora indiscutivelmente o modelo que se aproxima mais dos requisitos da pesquisa oftalmóica, estão associados a fortes preocupações éticas. Um bom compromisso entre a eficiência dos sistemas de cultura celular e a situação real dos modelos in vivo animais são culturas organotípicas de explant retina. Tais culturas também reduzem o sofrimento animal, uma vez que não são realizadas intervenções in vivo.
Vários métodos foram descritos para a cultura de explanações de retina de diferentes espécies5,7,8. Nosso protocolo descreve uma técnica para o isolamento da neuroretina do camundongo juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE). Esta técnica também será adequada para culturas de retina de ratos9. A cultura da neuroretina junto com seu RPE é de grande importância para o sucesso. O RPE realiza funções essenciais para a retina: transporte de nutrientes, íons, água, absorção de luz e proteção contra fotooxidação, re-isomerização de toda trans-retinal em 11-cis-retinal, que é crucial para o ciclo visual, fagocitose de membranas fotorreceptoras de galpão, e secreção de fatores essenciais para a integridade estrutural da retina10. A manutenção do RPE permite um desenvolvimento bem-sucedido de segmentos externos e internos fotorreceptor, mantendo a retina viável por mais tempo11. O procedimento descrito abaixo preserva as características histópicas e fisiológicas da retina por pelo menos duas semanas12. Além disso, a cultura das explanações de retina organotípicas em meio livre de soro e sem antibióticos evita a presença de substâncias desconhecidas e permite uma interpretação direta dos resultados12.
As culturas organotípicas de explantamento da retina têm sido essenciais para melhorar nosso conhecimento sobre desenvolvimento da retina e degeneração7,13,14. Mostramos aqui que eles também são uma ferramenta útil para a triagem farmacológica e que eles podem ser empregados para modelar uma variedade de doenças da retina, incluindo a retinopatia diabética.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+/-)-&#945;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDP-Choline-Na</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &#215; 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&#181;m</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3942.101</td>
			<td>for Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-CysteineHCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 x 4H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaSeO3 x 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>10360-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>21935025</td>
			<td>44 mAnson U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>07491252A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.22&#181;m</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>for supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopherylacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

Na pesquisa oftalmica, há uma forte necessidade de modelos in vitro da neuroretina. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a cultura organotípica daretina neurodo camundongo com epitélio pigmento de retina intacto (RPE). Dependendo da questão da pesquisa, as retinas podem ser isoladas de animais do tipo selvagem ou de modelos de doenças, para estudar, por exemplo, retinopatia diabética ou degeneração da retina hereditária. Olhos do início do pós-natal 2-9 animais são enucleados sob condições assépticas. São parcialmente digeridos em proteinase K para permitir um descolamento do coroide do RPE. Sob o estereoscópio, uma pequena incisão é feita na córnea criando duas bordas de onde o coroide e esclera podem ser suavemente descascados do RPE e neuroretina. A lente é então removida, e a pálpebra é cortada em quatro pontos para dar-lhe uma forma de quatro cunhas semelhante a uma folha de trevo. O tecido é finalmente transferido em uma gota de enforcamento em uma inserção de cultura celular segurando uma membrana de cultivo de policarbonato. As culturas são então mantidas em meio R16, sem soro ou antibióticos, em condições totalmente definidas, com uma mudança média a cada dois dias.
O procedimento descrito permite o isolamento da retina e a preservação de seu contexto fisiológico normal e histotípico para períodos de cultivo de pelo menos 2 semanas. Essas características tornam as culturas de explantização da retina organotípica um excelente modelo com alto valor preditivo, para estudos sobre desenvolvimento da retina, mecanismos de doença e eletrofisiologia, ao mesmo tempo em que permitem o rastreamento farmacológico.

Após seguir o protocolo, explanações de retina dissecadas e cultivadas preservam sua arquitetura de tecido normal, com camadas distintas, do RPE à camada de células gânglios (GCL), como mostra a Figura 2. A camada nuclear externa (ONL) e o tamanho da camada nuclear interna (INL) permaneceram principalmente estáveis por 2-3 semanas, com uma perda celular em progresso lento e a redução gradual dessas camadas se tornando cada vez mais aparente se o período de cultivo for prolongado para 4 semanas e além. Na GCL, em contraste, por causa da axotomia do nervo óptico, um afinamento acentuado é geralmente observado nos primeiros 4 dias de cultivo. Posteriormente, a população de células remanescentes no GCL (células amacrinas deslocadas) continuará a ser viável por mais 3-4 semanas17,18,19.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Figura 2: Tipos celulares encontrados na cultura da explant da retina. A cultura de explantamento de retina em P11 derivada de animais mutantes rd1 (A) e WT(B) mostrando coloração nuclear com DAPI (esquerda, azul), fotorreceptores de vara (centro, vermelho) e células Müller (direita, verde). A coloração nuclear destaca todas as principais camadas celulares da retina, tais como, epitélio de pigmento da retina (RPE), camada nuclear externa (ONL), camada nuclear interna (INL) e camada celular de gânglio (GCL). Tipos de células específicas nas camadas nucleares, como varas e células Müller, são imunolabeled com prisão alfa em26 e sitese glutamina27 anticorpos, respectivamente. (C) Mostra a seção de comprimento total de uma retina inteira do rato   RD1, com a coloração DAPI destacando a consistência, integração e desenvolvimento da retina. Essas retinas foram cultivadas por 6 dias. Descrição do procedimento: Retina e RPE derivados de animais rd1 ou WT foram isolados em P5 e cultivados como descrito no protocolo, até P11 com uma alteração média a cada 48 h. As culturas foram fixadas com 4% de PFA na P11 e criosectionadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura</a>
O meio sem soro e o ambiente in vitro sustentado permitem ter controle total sobre as condições experimentais. Aqui, fornecemos dois exemplos para aplicações específicas deste protocolo. O primeiro exemplo ilustra a possibilidade de usar explanações de retina para testes ou rastreamento de drogas. As culturas organotípicas de explant de retina foram preparadas a partir de modelos de camundongos do tipo selvagem (WT) e rd1. Este último é um modelo bem caracterizado para degeneração da retina15. Na retina do rato rd1, a degeneração ONL é desencadeada por níveis anormalmente altos de cGMP em fotorreceptores de vara6,20. O CGMP excessivo causa aumento da atividade dos canais de íons fechados nucleotídeos cíclicos (CNGCs) e da quinase proteica dependente de CGMP (PKG), levando à morte celular21. O tratamento de retinas de camundongos rd1 com um análogo estrutural ao cGMP (nucleotídeo cíclico #3; CN003), que tem como alvo pkg e CNGC, foi testado. Após a explantação em P5, seguiu-se o paradigma de tratamento descrito na Figura 3A. As culturas explant foram fixadas com 4% de PFA na P11 e preparadas para o criosectioning(Figura 3A). Para avaliar a morte celular de seções histológicas de amostras tratadas, não tratadas (NT) e WT,foi realizado um ensaio terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL). A análise das células rotuladas tunel mostrou uma alta porcentagem de células moribundas no ONL dos espécimes não tratados rd1, enquanto o CN003 protegeu os fotorreceptores do rato rd1 quando aplicados a uma concentração de 50 μM23 (Figura 3B).
Uma complicação frequente do diabetes é a retinopatia diabética, uma doença cegante que é difícil de reproduzir fielmente nos modelos animais5. O segundo exemplo destaca o uso de culturas organotípicas de explant retina para caracterizar a viabilidade celular da retina em condições que emulam diabetes mellitus tipo 2 (T2DM)24. Aqui, usamos 20 mM do inibidor de glicolise 2-desoxy-glicose (2-DG)25 e administrámo-lo ao meio de cultura por 24 horas de P10 a P11. Mostramos que submeter explanações de retina WT a tais condições diabéticas simuladas in vitro leva à morte celular neuronal extensiva da retina(Figura 3C). Esse paradigma, por sua vez, pode ser utilizado, por exemplo, para estudar mecanismos degenerativos ou testar tratamentos retinoprotetores em um contexto de diabetes.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Figura 3: Dois exemplos para aplicações de culturas organotípicas de explantamento de retina. (A) Descrição do procedimento: Retina e RPE derivados de animais rd1 ou WT foram isolados no dia pós-natal (P) 5 e cultivados como descrito acima, com uma mudança média a cada 48 h. Em P7 e P9, o meio gasto foi descartado e o cm fresco contendo composto ativo em uma concentração de 50 μM foi adicionado à placa. As culturas foram fixadas com 4% de PFA na P11 e criosectionadas. (B) Teste composto na retina rd1. As seções foram obtidas a partir de culturas de TR, tratadas (003) e não tratadas (NT) de explantagem organotípica da retina. O ensaio TUNEL (vermelho) foi usado como marcador para morte celular. Coloração nuclear com DAPI (azul). A quantificação mostrada no gráfico da barra ilustra as percentagens das células moribundas em WT, rd1 NT e rd1 003 condição. Tratamento com composto 003 reduziu significativamente a morte celular do fotorreceptor rd1. (C) Simulação do diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) na retina WT utilizando tratamento 2-deoxy-glicose (2-DG). O ensaio TUNEL foi realizado em amostras NT e T2DM. A quantificação indica um aumento altamente significativo na morte celular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura</a>
Tabela S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Clique aqui para baixar a tabela</a>  
Mesa S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Clique aqui para baixar a tabela</a>  
Mesa S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">Clique aqui para baixar a tabela</a>

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Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

O protocolo descreve explanações organotípicas daretina neurodo camundongo, cultivadas juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE), em meio definido r16, livre de soro e antibióticos. Este método é relativamente simples de executar, menos caro e demorado quando comparado com experimentos in vivo, e pode ser adaptado a inúmeras aplicações experimentais.

Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.4K visualizações.  University of Tübingen. O protocolo descreve explanações organotípicas daretina neurodo camundongo, cultivadas juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE), em meio definido r16, livre de soro e antibióticos. Este método é relativamente simples de executar, menos caro e demorado quando comparado com experimentos in vivo, e pode ser adaptado a inúmeras aplicações experimentais.

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Modelos experimentais para estudo da fisiologia epitélio pigmentar da retina e Fisiopatologia

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Neurociência

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human retina and is therefore a valuable species for studying mechanisms of human retinal injury and degenerative disease. Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina isolated from eyes obtained from an abattoir. After removing the anterior segment, a trephine blade was used to create multiple neural retina-Bruch's membrane-RPE-choroid-sclera explants from the posterior segment of adult porcine eyes. A piece of sterile filter paper was used to lift the neural retina off from each explant. The filter paper-retina complex was cultured (photoreceptor side up) atop an insert, which was held away from the bottom of the culture dish by a custom-made stand. The stand allows for good circulation of the culture medium to both sides of the retina. Overall, this procedure is simple, reproducible, and permits preservation of native retinal structure for at least seven days, making it a useful model for a variety of morphological, pharmacological, and biochemical studies on mammalian retina.

Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina for seven days. Briefly, a sterile filter paper was used to lift the neural retina off from the RPE and place photoreceptor side up on an insert raised by a custom-made stand.

Cultura organotípicas de Full-espessura Retina Porcina Adulto

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

A polido e reforçado Janela afinado crânio para longo prazo de imagens do cérebro de camundongo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

Uma preparação semi-intactas isolada do Rato Vestibular epitélio sensorial de Eletrofisiologia e de alta resolução Microscopia de dois fótons

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers agarose para Imagem de cálcio a longo prazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbo Abordagem-Subretinal injeção de vetores virais para terapia genética em ratos Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Geração e Manutenção a Longo Prazo de Nerve-free<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...