Name: long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
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Diese Forschungsarbeiten wurden von der Europäischen Union finanziell unterstützt (transMed; H2020-MSCA-765441), der Deutsche Forschungsrat (DFG; PA1751/8-1, 10-1) und dem China-Stipendienrat.

Tierprotokolle, die dem Tierschutzgesetz nr. 4 entsprechen, wurden vom Tübinger Tierschutzausschuss überprüft undgenehmigt. Registrierungs-Nr. AK02/19M). In dieser Studie wurden Netzhaut von Wildtyp-Mäusen (WT) und Rd1-Mäusen gewonnen, wobei letztere ein gut charakterisiertes Modell für die erbliche Netzhautdegeneration15waren. Mäuse wurden unter weißer zyklischer Standardbeleuchtung untergebracht, hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser und wurden unabhängig vom Geschlecht verwendet.
1. Checkliste
<ol><li>Um sterile Bedingungen zu gewährleisten und Verunreinigungen zu vermeiden, reinigen und desinfizieren Sie die laminare Luftstromhaube mit 70% Ethanol. Achten Sie darauf, das Ethanol vollständig verdampfen zu lassen, um eine Vergiftung der Netzhautkulturen zu verhindern.</li>
	<li>Autoklavwerkzeuge (z. B. Schere, Zange und ophthalmologischer Mikroskop-Schrumpflöffel) vor dem Gebrauch.</li>
	<li>Bereiten Sie folgende Medien im Voraus unter einer laminaren Stromhaube unter sterilen Bedingungen vor: Basal R16 medium (BM) (kann 4 Wochen bei 4 °C gelagert werden), BM mit 20% fetalem Kalbsserum (FCS) (am selben Tag), BM mit 0 .12% Proteinase K (44 mAnson U/mg) Lösung (Am selben Tag) und komplettes R16-Medium mit Ergänzungen (CM) wie von Romijn16 beschrieben (kann bei 4 °C für 3 Wochen gelagert werden) (siehe Tabellen S1, S2 und S3).</li>
	<li>Die Proteinase-K-Lösung bei 37 °C vorheizen, um sie zu aktivieren und in Schritt 2.5 zu verwenden.</li>
</ol>2. Vorbereitung
<ol><li>Opfern rd1/WT Tier am postnatalen Tag (P) 5 durch Enthauptung. Für Tiere, die älter als P11 sind, verwenden Sie CO2 und/oder Zervixdislokation gemäß den örtlichen Tierschutzbestimmungen.</li>
	<li>Je nach Alter des Tieres, vor der Enukleation, bei Bedarf, öffnen Sie die Augenlider mit Zangen und sehr sorgfältig trennen Sie die Augenlider, ohne das Auge unten zu berühren oder zu kratzen.</li>
	<li>Die Augen unter einem Stereoskop mit gekrümmten Zangen schnell enukleieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Augen in BM für 5 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Augen in vorgewärmtem BM, mit 0,12% Proteinase K bei 37 °C für 15 min.</li>
	<li>Führen Sie die folgenden Schritte in einer laminaren Luftstromhaube aus, um sterile Bedingungen zu gewährleisten. Um Proteinase K zu inaktivieren, übertragen Sie die Augen auf BM, die 20% FCS enthalten, und inkubieren Sie für 5 min bei RT.</li>
	<li>Sezieren Sie die Augen unter einem Stereoskop, aseptisch, in einer Petrischale mit frischem BM bei RT. Initiieren Sie die Sezierung so schnell wie möglich nach der Enukleation. Je länger diese Zeit ist, desto schwieriger ist es, die Netzhaut zu sezieren, die Augen werden sehr weich.<ol>
<li>Halten Sie mit Einer Zange das Auge vom Sehnerv. Mit einer feinen Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt in der Hornhaut, wo 2 Kanten, von wo die Hornhaut, die Aderundin und die Sklera sanft geschält werden können mit 2 Paar feinen Zangen(Abbildung 1 Schritte A-C). Alternativ können Sie eine Schmalspurkanüle verwenden, um einen ersten Schnitt in die Hornhaut zu machen, und dann eine der Scherenklingen in die Öffnung einsetzen.</li>
		<li>Greifen Sie die Linse mit feiner Zange. Platzieren Sie ein zweites Zangenpaar senkrecht zu den ersten, so dass sich die ersten Zangen zwischen den beiden Schaften des zweiten befinden. Ziehen Sie, um die Linse aus der Augenschale zu extrahieren. Wenn der Glaskörper und der Ziliarkörper noch an der Netzhaut befestigt sind, entfernen Sie sie sorgfältig(Abbildung 1 Schritt D). HINWEIS: Die Schritte 2.7.1 und 2.7.2 müssen geübt werden und achten Sie darauf, dass die Netzhaut nicht beschädigt wird.</li>
		<li>Schneiden Sie die Netzhaut senkrecht zu ihren Rändern in vier Punkte, wodurch eine vierblättrige Kleeform entsteht(Abbildung 1 Schritte E–F).</li>
		<li>Mit einer Pipette mit breit geschnittener Basis einer 1 ml Spitze die Netzhaut in einem hängenden Tropfen des Mediums halten und in einen Kulturschalenfiltereinsatz übertragen, der in eine 6-Well-Kulturplatte gelegt wird. Die RPE-Schicht sollte der Membran gegenüberstehen(Abbildung 1 Schritt G).</li>
		<li>Entfernen Sie mit einer Pipette vorsichtig das überschüssige Medium aus dem Einsatz.</li>
		<li>Von den Seiten des Brunnens 1 ml CM pro Brunnen hinzufügen und in einem sterilen Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2brüten. Tauchen Sie die Netzhaut nicht in das Medium, da dies die Sauerstoffversorgung reduziert und Gewebedegeneration verursacht. Die Explantation sollte an der Schnittstelle zwischen Flüssigkeit und Luft bleiben, nur durch einen dünnen Flüssigkeitsfilm bedeckt, der durch die Oberflächenspannung von Wasser erzeugt wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lassen Sie die Netzhautexplantation für die ersten 48 h ungestört, um die Genesung nach dem Explantationsverfahren zu erleichtern.</li>
	<li>Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag (48 h). Entsorgen Sie 700 l Medium aus jedem Brunnen und fügen Sie 900 l frischen CM in den Brunnen. Auf diese Weise wird die Menge des durch Verdunstung verlorenen Mediums wiederhergestellt und die Netzhautexplantation behält einige der neuroprotektive Faktoren, die in den vorherigen 48 h produziert wurden.</li>
	<li>Inkubieren Sie das entfernte Medium in einem separaten und geschlossenen Mikrozentrifugenrohr zusammen mit den Kulturen, um mögliche Verunreinigungen zu kontrollieren und zu bewerten (d. h. Farbänderung des Mediums). HINWEIS: Netzhaut-Expflanzen können in Kultur für mindestens 2 Wochen gehalten werden12.</li>
</ol>3. Nach der Kultivierung
HINWEIS: Explanten können für verschiedene experimentelle Anwendungen (Westlicher Fleck, Histologie, ganze Reittiere, genetische Analyse, Elektrophysiologie) verwendet werden. Je nach Anwendung können organotypische Netzhautexpflanzen eingefroren, lysiert oder für die Kryosektion vorbereitet werden. Die folgenden Schritte beschreiben die histologische Vorbereitung.
<ol><li>Führen Sie eine 45-min-Fixierung mit 4% Paraformaldehyd (PFA), gefolgt von allmählichem Saccharose-Kryoschutz (10% Saccharose für 10 min, 20% für 20 min und 30% für 2 h bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht (ON) bei 4 °C). Fügen Sie diese Puffer direkt in den Brunnen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Membran um die retinalen Explanten.</li>
	<li>Einbetten sowohl der Membran als auch des Netzhautgewebes in das Medium für gefrorenes Gewebe.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Abbildung 1:Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung organotypischer netzretinaler Explantationskulturen. (A) Mausaugen werden enukleiert und auf eine Lösung der Proteinase K übertragen, um die Trennung von Sklera und Aderhaut von der Netzhaut und RPE zu ermöglichen. Ein kleiner Schnitt in der Sklera/Choroidschicht wird eingeführt. (B) Zwei Zangen werden verwendet, um die Sklera/Choroidschicht zu schälen. (C) Die schwarze Aderhautschicht ist während des Peelings zu sehen. Das unterlegende dunkle retinale Pigmentepithel (RPE) bleibt am Augapfel befestigt. Die Sklera und Die Aderhaut werden zusammen mit dem Sehnerv entfernt. (D) Die Linse und der Glaskörper werden mit Zangen extrahiert.  Der verbleibende Ziliarkörper wird entfernt. (E) Die Netzhaut behält eine schüsselartige Form. (F) Um die Netzhaut für die Kultivierung in einer Schale abzuflachen, werden 4 Schnitte in gleichem Abstand um die Netzhaut mit einer Schere gemacht, was ihr eine kleeähnliche Form verleiht. Die Netzhautkultur wird mit hilfe einer geschnittenen 1 ml Pipettenspitze auf einen Membrankultureinsatz in einer 6-Well-Platte übertragen. Die Netzhaut behält noch einen Teil der Schalenform. Bei Entfernung der überschüssigen Flüssigkeit, die die Netzhaut umgibt, entfaltet sie sich jedoch zu einer planaren Struktur. (G) Im Kulturmembranaufbau ruht die Netzhautkultur auf einer porösen Polycarbonatmembran (PC) auf einer Lösung des kompletten R16-Mediums. Um die Lebensfähigkeit zu gewährleisten, muss die Kultur in einem befeuchteten sterilen Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2gehalten werden, und das Medium sollte alle 48 h ausgetauscht werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das vorgestellte Protokoll beschreibt organotypische Explantienkulturen der Mausnetzhaut mit intaktem RPE in definiertem R16-Medium, frei von Serum und Antibiotika. Dieses Protokoll wurde ursprünglich in den späten 1980er Jahrenentwickelt 7,28 und seitdem wurde es kontinuierlich verfeinert6,11,12. Bemerkenswerte Anwendungen sind Studien über die Mechanismen der erblichen Netzhautdegeneration und die Identifizierung von retinoprotektive Medikamente23,29,30.
Für ein erfolgreiches Experiment müssen einige wichtige Überlegungen berücksichtigt werden. Hier sind einige wichtige Fehlerbehebungspunkte, um die Qualität der Kulturen zu verbessern. Erstens können die Netzhautkulturen übermäßige Faltung und/oder Rosettenbildungzeigen 31. Dies kann durch Berühren der Netzhaut mit einer Zange während des Explantationsvorgangs verursacht werden. Darüber hinaus muss der Ziliarkörper vollständig aus der Explantation entfernt werden, da dies die Netzhautfaltung während der Kultur erhöhen kann. Zweitens, während der Übertragung der Netzhaut auf die Brunnenplatte in einem hängenden Tropfen, wenn die Netzhaut der Membran die falsche Seite nach unten zeigt, halten Sie es in den Tropfen hängen an der Pipette Spitze und sehr sanft drücken Sie das Medium in und aus der Spitze (ohne den hängenden Tropfen zu lösen), um die Netzhaut umzudrehen. Schließlich, wenn das RPE an der Sklera befestigt bleibt und sich von der Netzhaut löst, wird es höchstwahrscheinlich durch eine unzureichende Präverdauung der Sklera verursacht. Dieses Problem kann besonders wichtig sein, wenn es mit Augen älterer Tiere oder Nicht-Nagetierarten (z. B. Schweine) arbeitet und durch Erhöhung der Proteinase-K-Konzentration gelöst werden kann.
Die Durchführung organotypischer Netzhautexplantationskulturen ist ein komplexes Verfahren, das eine angemessene Ausbildung und Erfahrung erfordert. Mangelndes Training kann zu Einer Variabilität der Qualität der Netzhautexplantationen führen. Aus diesen Gründen ist es wichtig, die Lebensfähigkeit und Reproduzierbarkeit zu überwachen und zu überprüfen, indem beispielsweise die Rate des Zelltodes mit dem TUNEL-Assay charakterisiert wird. Der Einsatz eines antibiotikafreien Mediums macht die Netzhautexplantationen anfällig für eine Kontamination durch Bakterien und Pilze. Um dieses Risiko zu minimieren, empfehlen wir, besonders darauf zu achten, unter wirklich aseptischen Bedingungen zu arbeiten. Eine weitere Einschränkung der in vitro retinalen Kultivierung sind Unterschiede in der physiochemischen Umgebung im Vergleich zur in vivo Netzhaut (z. B. Aderhaut- und Netzhautblutversorgung, Sauerstoff- und Glukosespiegel, Augeninnendruck, Zusammensetzung des Glaskörpers). Ein kontinuierliches Perfusionssystem, das vielleicht in einen speziellen Bioreaktor32 eingebettet ist, könnte dieses Modell näher an den In-vivo-Zustand bringen. Darüber hinaus führt die Axotomie des Sehnervs während der Netzhautsektion zum Tod von Ganglienzellen, die Stressreaktionen induzieren können8. Daher ist es empfehlenswert, dass das Explant mindestens 2 Tage in vitro an Kultivierungsbedingungen angepasst werden muss, bevor es einer spezifischen Manipulation oder Behandlung unterzogen wird.
Die beschriebene Methode wird in der Regel auf unreife Netzhautgewebe durchgeführt, die gut überleben können für 4 Wochen in vitro7,33. Das Verfahren ist jedoch auf eine Vielzahl von Anwendungen zugeschnitten, einschließlich der Kultivierung der adulten Netzhaut. Obwohl verschiedene veröffentlichte Ansätze die Isolierung der adulten Netzhaut ohne ihre RPE34,35beschreiben, ermöglicht die Inkubation mit Papainlösung für bis zu 1 h bei 37 °C vor der Zerlegung, dass das RPE an der Netzhaut befestigt bleibt, selbst wenn es von einer erwachsenen Maus abgeleitet ist36.
Das serumfreie Medium und die chemisch definierte In-vitro-Umgebung sorgen für eine vollständig definierte und reproduzierbare Manipulation der Versuchsbedingungen. Daher sind organotypische netzhaut-Explantationskulturen wertvolle Werkzeuge auf dem Gebiet der Ophthalmologie und Neurowissenschaften und wurden für die Untersuchung von Netzhauterkrankungen37, Netzhautentwicklung38,39, Netzhautstammzelltherapie40, genetische Modifikationen41und pharmakologisches Screening verwendet. Als spezifisches Beispiel für Arzneimitteltests haben wir hier retinale Explantationskulturen verwendet, um ein cGMP-Analogon (CN003) zu testen, bekannt, um den Tod von Photorezeptorzellen in Tiermodellen für vererbte Netzhauterkrankungen zu reduzieren23 (Abbildung 3B). Eine weitere mögliche Anwendung der Technik wird in Abbildung 3Cbeschrieben, die zeigt, wie die präzise Kontrolle der Gewebeumgebung genutzt werden kann, um diabetische Bedingungen zu emulieren24. Aufgrund der Erhaltung der Gewebearchitektur über die gesamte Kultivierungsperiode eignen sich organotypische Netzhautexplantationskulturen auch für elektrophysiologische Studien. Neuronale Funktionalität auf retinalen Explants wurden mit Patch-Clamp-Aufnahme42 und Multi-Elektroden-Array (MEA) Aufzeichnung33,43untersucht. Letzteres ermöglicht die gleichzeitige Erfassung der elektrischen Aktivität neuronaler Populationen und wurde genutzt, um die Funktionalität von Photorezeptor- und Ganglienzellen unter Kulturbedingungen zu charakterisieren. In einer breiteren Perspektive können die organotypischen Explantenkultursysteme auch in der präklinischen Forschung angewendet werden, wo Explantienkulturen verwendet wurden, um die therapeutische Wirksamkeit der Hypothermie zu testen44.
Die organotypische Explant-Kultivierungstechnik ist relativ einfach durchzuführen und im Vergleich zu entsprechenden In-vivo-Experimenten kostengünstiger und zeitaufwändiger und vermeidet die ethischen Bedenken im Zusammenhang mit Studien lebender Tiere. Die präzise Kontrolle der experimentellen Bedingungen und die Erhaltung der RPE- und Gewebekomplexität machen die Methode zu einem wertvollen Werkzeug, um unser Wissen über Netzhautphysiologie und Pathophysiologie zu verbessern und zahlreiche experimentelle Anwendungen zu ermöglichen.

In der ophthalmologischen Forschung stehen eine Vielzahl von Modellen zur Verfügung, um die Netzhaut zu untersuchen, einschließlich primärer Netzhautzellkulturen, retina-abgeleiteter Zelllinien, retinaler Organoide und in vivo Tiermodelle1,2,3,4,5. Jedes dieser Modelle leidet jedoch unter Nachteilen. Zum Beispiel wachsen Zellen isoliert, während die Netzhaut ein komplexes Netzwerk mit einer Vielzahl von Zell-zu-Zell-Interaktionen ist. Daher ist das Verhalten isolierter Zellkulturen wahrscheinlich künstlich im Vergleich zu dem, das in einem ganzen Gewebe beobachtet wird. Dieses Problem kann zum Teil mit in vitro differenzierten Retina-Organoiden behoben werden, die verwendet werden können, um Entwicklung und grundlegende Biologie zu studieren6. Dennoch ist die Retinal-Organoid-Generation bis heute zeitaufwändig, arbeitsintensiv und leidet unter Reproduzierbarkeitsproblemen, die umfangreiche Weiterentwicklungsarbeit erfordern, bevor Organoide für die translationale Netzhautforschung verwendet werden können. Schließlich sind Studien an lebenden Tieren, obwohl das Modell, das den Anforderungen der ophthalmologischen Forschung am nächsten kommt, mit starken ethischen Bedenken verbunden. Ein guter Kompromiss zwischen der Effizienz von Zellkultursystemen und der realen Situation von in vivo Tiermodellen sind organotypische Netzhautexplantationskulturen. Solche Kulturen reduzieren auch das Leiden der Tiere, da keine In-vivo-Interventionen durchgeführt werden.
Es wurden mehrere Methoden zur Kultivierung von Retinalen Expflanzen verschiedener Arten5,7,8beschrieben. Unser Protokoll beschreibt eine Technik zur Isolierung der Mausneuroretina zusammen mit ihrem retinalen Pigmentepithel (RPE). Diese Technik wird auch für Ratte Netzhautkulturen9geeignet sein. Die Kultur der Neuroretina zusammen mit ihrem RPE ist von großer Bedeutung für den Erfolg. Das RPE erfüllt wesentliche Funktionen für die Netzhaut: Transport von Nährstoffen, Ionen, Wasser, Absorption von Licht und Schutz vor Photooxidation, Re-Isomerisierung von All-Trans-Retinal in 11-cis-retinal, was für den visuellen Zyklus entscheidend ist, Phagozytose von Schuppen photorezeptormembranen, und Sekretion von wesentlichen Faktoren für die strukturelle Integrität der Netzhaut10. Die Aufrechterhaltung des RPE ermöglicht eine erfolgreiche Entwicklung von Photorezeptor-Außen- und Innensegmenten, wodurch die Netzhaut länger lebensfähig bleibt11. Das unten beschriebene Verfahren bewahrt die histotypischen und physiologischen Eigenschaften der Netzhaut für mindestens zwei Wochen12. Darüber hinaus vermeidet die Kultivierung der organotypischen Netzhautexplantationen in serumfreiem, antibiotikafreiem Medium das Vorhandensein unbekannter Substanzen und ermöglicht eine einfache Interpretation der Ergebnisse12.
Organotypische Netzhautexplantationskulturen waren wesentlich für die Verbesserung unseres Wissens über Netzhautentwicklung und Degeneration7,13,14. Wir zeigen hier, dass sie auch ein nützliches Werkzeug für pharmakologisches Screening sind und dass sie eingesetzt werden können, um eine Vielzahl von Netzhauterkrankungen zu modellieren, einschließlich diabetischer Retinopathie.

<table><tbody><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>(+/-)-&amp;alpha;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>CDP-Choline-Na</td><td>Sigma</td><td>30290</td><td></td></tr><tr><td>Corticosterone</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;times; 5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C8027</td><td></td></tr><tr><td>DL-Tocopherol</td><td>Sigma</td><td>T1539</td><td></td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma</td><td>E0135</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&amp;micro;m</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3942.101</td><td>for Basal Medium</td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>L-CysteineHCl</td><td>Sigma</td><td>C7477</td><td></td></tr><tr><td>Linoleic Acid</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Linolenic Acid</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;x 4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P3662</td><td></td></tr><tr><td>NaSeO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;x 5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td><td>F.S.T.</td><td>10360-13</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>21935025</td><td>44 mAnson U/mg</td></tr><tr><td>R16</td><td>Gibco</td><td>07491252A</td><td></td></tr><tr><td>Retinol</td><td>Sigma</td><td>R7632</td><td></td></tr><tr><td>Retinyl acetate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>F.S.T</td><td>15004-08</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filter 0.22&amp;micro;m</td><td>MILLEX GP</td><td>SLGP033RS</td><td>for supplements</td></tr><tr><td>T3&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Tocopherylacetate</td><td>Sigma</td><td>T1157</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td></td></tr><tr><td>Transwell permeable supports</td><td>Corning</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B1</td><td>Sigma</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin C</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr></tbody></table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

In der ophthalmologischen Forschung besteht ein starker Bedarf an In-vitro-Modellen der Neuroretina. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur organotypischen Kultivierung der Mausneuro-Retina mit intaktem retinalen Pigmentepithel (RPE) vor. Je nach Forschungsfrage können Netzhaut von Wildtieren oder von Krankheitsmodellen isoliert werden, um beispielsweise diabetische Retinopathie oder erbliche Netzhautdegeneration zu untersuchen. Die Augen vom frühen postnatalen Tag 2 bis 9 Tiere werden unter aseptischen Bedingungen enukleiert. Sie werden teilweise in Proteinase K verdaut, um eine Ablösung der Aderhaut vom RPE zu ermöglichen. Unter dem Stereoskop wird ein kleiner Schnitt in der Hornhaut gemacht, wo zwei Kanten entstehen, von denen die Aderhaut und Sklera sanft von der RPE und Neuroretina abgeschält werden können. Die Linse wird dann entfernt, und die Augenmuschel wird in vier Punkte geschnitten, um ihr eine vierkeilige Form zu geben, die einem Kleeblatt ähnelt. Das Gewebe wird schließlich in einem hängenden Tropfen in einen Zellkultureinsatz mit einer Polycarbonat-Kultivierungsmembran übertragen. Die Kulturen werden dann in R16 medium, ohne Serum oder Antibiotika, unter vollständig definierten Bedingungen, mit einer mittleren Veränderung jeden zweiten Tag gepflegt.
Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Isolierung der Netzhaut und die Erhaltung ihres normalen physiologischen und histotypischen Kontextes für Kultivierungsperioden von mindestens 2 Wochen. Diese Eigenschaften machen organotypische Netzhautexplantationskulturen zu einem ausgezeichneten Modell mit hohem Vorhersagewert für Studien zur Netzhautentwicklung, Zustände und Elektrophysiologie und ermöglichen gleichzeitig ein pharmakologisches Screening.

Nach dem Befolgen des Protokolls bewahren sezierte und kultivierte Netzhautexplanten ihre normale Gewebearchitektur mit unterschiedlichen Schichten, vom RPE bis zur Ganglienzellschicht (GCL), wie in Abbildung 2dargestellt. Die Größe der äußeren Kernschicht (ONL) und der inneren Kernschicht (INL) blieb 2-3 Wochen lang weitgehend stabil, wobei ein langsam fortschreitender Zellverlust und eine allmähliche Ausdünnung dieser Schichten immer deutlicher werden, wenn die Kultivierungszeit auf 4 Wochen und darüber hinaus verlängert wird. Im GCL hingegen wird aufgrund der Axotomie des Sehnervs in der Regel innerhalb der ersten 4 Tage der Kultivierung eine deutliche Ausdünnung beobachtet. Danach wird die verbleibende Zellpopulation in der GCL (meist verdrängte Amacrine-Zellen) für weitere 3-4-Wochen17,18,19lebensfähig bleiben.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Abbildung 2:Zelltypen, die in derretinalen Explantationskultur gefunden werden. Netzhautexplantationskultur bei P11 abgeleitet von rd1 Mutant (A) und WT-Tieren (B) zeigt nukleare Färbung mit DAPI (links, blau), Stab-Photorezeptoren (Mitte, rot) und Müller-Zellen (rechts, grün). Die Kernfärbung hebt alle wichtigen zellulären Schichten der Netzhaut hervor, wie z. B. retinalepigmentepithel (RPE), äußere Kernschicht (ONL), innere Kernschicht (INL) und Ganglienzellschicht (GCL). Spezifische Zelltypen in den Kernschichten, wie Z.B. Stäbe und Müller-Zellen, sind immunlabeliert mit Alpha-Arrestin26 bzw. Glutamin-Synthetase-27-Antikörpern. (C) Zeigt den gesamten Abschnitt einer ganzen   rd1-Maus-Retina mit DAPI-Färbung an, die die Konsistenz, Integration und Entwicklung der Netzhaut hervorhebt. Diese Netzhaut wurde für 6 Tage kultiviert. Verfahrensbeschreibung: Retina und RPE, abgeleitet von rd1 oder WT-Tieren, wurden bei P5 isoliert und, wie im Protokoll beschrieben, bis P11 mit einer mittleren Veränderung alle 48 h kultiviert. Kulturen wurden mit 4% PFA bei P11 fixiert und kryosectioniert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen</a>
Serumfreies Medium und die nachhaltige In-vitro-Umgebung ermöglichen die volle Kontrolle über die experimentellen Bedingungen. Hier stellen wir zwei Beispiele für spezifische Anwendungen dieses Protokolls bereit. Das erste Beispiel veranschaulicht die Möglichkeit, Netzhautexplantationen für Arzneimitteltests oder Screening-Zwecke zu verwenden. Organotypische Netzhautexplantationskulturen wurden aus Wildtyp-(WT) und rd1-Mausmodellen hergestellt. Letzteres ist ein gut charakterisiertes Modell für die Netzhautdegeneration15. In der rd1 MausNetzhaut wird die ONL-Degeneration durch ungewöhnlich hohe cGMP-Werte in Stabphotorezeptoren6,20ausgelöst. Übermäßige cGMP verursacht erhöhte Aktivität von zyklischen Nukleotid-Gated-Ionen-Kanälen (CNGCs) und cGMP-abhängiger Proteinkinase (PKG), was zum Zelltod21führt. Die Behandlung von rd1-Mausnetzhaut mit einem strukturellen Analog zu cGMP (zyklisches Nukleotid #3; CN003), das sowohl auf PKG als auch auf CNGC abzielt, wurde getestet. Nach der Explantation bei P5 wurde das in Abbildung 3A beschriebene Behandlungsparadigma befolgt. Die Explantkulturen wurden mit 4% PFA bei P11 fixiert und für die Kryosektion vorbereitet (Abbildung 3A). Zur Beurteilung des Zelltodes von histologischen Abschnitten aus behandelten, nicht behandelten (NT) und WT-Proben wurde ein terminaler Desoxynukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) Assay22 durchgeführt. Die Analyse von TUNEL-markierten Zellen zeigte einen hohen Anteil sterbender Zellen im ONL der rd1 unbehandelten Proben, während CN003-geschützte rd1-Mausphotorezeptoren bei einer Konzentration von 50 m23 (Abbildung 3B) aufgetragen wurden.
Eine häufige Komplikation von Diabetes ist die diabetische Retinopathie, eine blendende Krankheit, die in Tiermodellen nur schwer originalgetreu zu reproduzieren ist5. Das zweite Beispiel zeigt die Verwendung von organotypischen retinalen Explant-Kulturen zur Charakterisierung der Lebensfähigkeit der Netzhautzellen unter Bedingungen, die Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM)24emulieren. Hier haben wir 20 mM des Glykolyseinhibitors 2-Deoxy-Glucose (2-DG)25 verwendet und 24 h von P10 bis P11 an das Kulturmedium verabreicht. Wir zeigen, dass die Unterwerung von WT-Retina-Explantationen solchen in vitro simulierten diabetischen Erkrankungen zu einem umfangreichen neuronalen Zelltod der Netzhaut führt (Abbildung 3C). Dieses Paradigma wiederum kann dann zum Beispiel verwendet werden, um degenerative Mechanismen zu studieren oder retinoprotektive Behandlungen in einem Diabetes-Kontext zu testen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Abbildung 3: Zwei Beispiele für Anwendungen organotypischer netzretinaler Explantationskulturen. (A) Verfahrensbeschreibung: Retina und RPE abgeleitet von rd1 oder WT-Tieren wurden am postnatalen Tag (P) 5 isoliert und wie oben beschrieben kultiviert, mit einer mittleren Veränderung alle 48 h. Bei P7 und P9 wurde das verbrauchte Medium verworfen und frischecm mit Wirkstoff in einer Konzentration von 50 m auf die Platte gesetzt. Kulturen wurden mit 4% PFA bei P11 fixiert und kryosectioniert. (B) Compound-Tests an der netzretina rd1. Abschnitte wurden aus WT, behandelt (003) und nicht behandelten (NT) organotypischen retinalen Explantationskulturen gewonnen. TUNEL Assay (rot) wurde als Marker für den Zelltod verwendet. Nukleare Färbung mit DAPI (blau). Die im Balkendiagramm dargestellte Quantifizierung veranschaulicht die Prozentsätze sterbender Zellen in WT, rd1 NT und rd1 003 Zustand. Die Behandlung mit Verbindung 003 reduzierte den Tod von rd1 Photorezeptorzellen signifikant. (C) Simulation von Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) auf der WT-Retina mit 2-Deoxy-Glucose (2-DG) Behandlung. DER TUNEL-Assay wurde an NT- und T2DM-Proben durchgeführt. Die Quantifizierung deutet auf einen sehr signifikanten Anstieg des Zelltodes hin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen</a>
Tabelle S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um die Tabelle herunterzuladen</a>  
Tabelle S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um die Tabelle herunterzuladen</a>  
Tabelle S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um die Tabelle herunterzuladen</a>

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Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Das Protokoll beschreibt organotypische Explanten der Maus NeuroRetina, kultiviert zusammen mit seinem retinalen Pigment epithel (RPE), in R16 definierten Medium, frei von Serum und Antibiotika. Diese Methode ist relativ einfach durchzuführen, im Vergleich zu In-vivo-Experimenten kostengünstiger und zeitaufwändigund und kann an zahlreiche experimentelle Anwendungen angepasst werden.

Langfristige, serumfreie Kultivierung organotypischer Maus-Retina-Explanten mit intaktem retinalen Pigmentepithel

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Serie: Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human retina and is therefore a valuable species for studying mechanisms of human retinal injury and degenerative disease. Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina isolated from eyes obtained from an abattoir. After removing the anterior segment, a trephine blade was used to create multiple neural retina-Bruch's membrane-RPE-choroid-sclera explants from the posterior segment of adult porcine eyes. A piece of sterile filter paper was used to lift the neural retina off from each explant. The filter paper-retina complex was cultured (photoreceptor side up) atop an insert, which was held away from the bottom of the culture dish by a custom-made stand. The stand allows for good circulation of the culture medium to both sides of the retina. Overall, this procedure is simple, reproducible, and permits preservation of native retinal structure for at least seven days, making it a useful model for a variety of morphological, pharmacological, and biochemical studies on mammalian retina.

Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina for seven days. Briefly, a sterile filter paper was used to lift the neural retina off from the RPE and place photoreceptor side up on an insert raised by a custom-made stand.

Organotypischen Kultur der Full-Dicke ausgewachsenen Schweinen Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Forschung

Neurowissenschaften

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic age-related macular degeneration (AMD) which represents 90% of the cases. Therapies are needed to slow or retard the development of geographic atrophy (GA), and understanding Bruch&#39;s membrane pathology is part of this process. Alterations in human Bruch&#39;s membrane precede the progression of AMD by contributing to the damage of retinal pigment epithelial (RPE) cells. Given the lack of sufficient animal models to study AMD, ex vivo models of aged human Bruch&#39;s membrane serve as a useful tool to study the behavior of RPE cells from immortalized and primary cell lines as well as RPE lines derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Here, we present a detailed method that allows one to determine the effects of RPE cell behavior seeded on harvested human Bruch&#39;s membrane explants from human donors, including attachment, apoptosis and proliferation, ability to phagocytize photoreceptor outer segments, establishment of polarity, and gene expression. This assay provides an ex vivo model of aged Bruch&#39;s membrane to assess the functional characteristics of RPE cells when seeded on aged/compromised extracellular matrix.

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

The goal of this protocol is to demonstrate the culturing of retinal pigment epithelial (RPE) cells on aged and/or diseased human Bruch&#39;s membrane. This method is suitable to study RPE cell behavior on a compromised extracellular matrix.

Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen auf einem Ex Vivo Modell der alten menschlichen Bruch-Membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

Entwicklungsbiologie

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of human-induced pluripotent stem cells (iPSCs) is particularly attractive for neurodegenerative disease studies, including retinal dystrophies, where iPSC-derived retinal cell models mark a major step forward to understand and fight blindness. In this paper, we describe a simple and scalable protocol to generate, mature, and cryopreserve retinal organoids. Based on medium changing, the main advantage of this method is to avoid multiple and time-consuming steps commonly required in a guided differentiation of iPSCs. Mimicking the early phases of retinal development by successive changes of defined media on adherent human iPSC cultures, this protocol allows the simultaneous generation of self-forming neuroretinal structures and retinal pigmented epithelial (RPE) cells in a reproducible and efficient manner in 4 weeks. These structures containing retinal progenitor cells (RPCs) can be easily isolated for further maturation in a floating culture condition enabling the differentiation of RPCs into the seven retinal cell types present in the adult human retina. Additionally, we describe quick methods for the cryopreservation of retinal organoids and RPE cells for long-term storage. Combined together, the methods described here will be useful to produce and bank human iPSC-derived retinal cells or tissues for both basic and clinical research.

The production of specialized retinal cells from pluripotent stem cells is a turning point in the development of stem cell-based therapy for retinal diseases. The present paper describes a simple method for an efficient generation of retinal organoids and retinal pigmented epithelium for basic, translational, and clinical research.

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, retina-specific or conditional knockout mouse models often display early lethality or suffer from severe malformations, preventing an analysis beyond embryonic or early postnatal stages.
Primary cell culture is an alternative to investigate the effects of exogenously applied recombinant factors, overexpression of genes or siRNA-mediated gene knockdown in a controlled environment. Dissociated cell culture has the advantage that the endogenous signals reaching the target cells are reduced, thereby facilitating the identification of exogenously triggered effects after pharmacological manipulation. However, important cell-cell interactions are initially destroyed by enzymatic digestion or mechanical dissociation, even if re-aggregated retinospheroid cultures1 are used.
By contrast, organotypic retinal wholemount cultures provide a system close to the physiological in vivo situation with neuronal interactions and connections still preserved2-5.
In this video article we provide a step by step demonstration of (1) the establishment of in vivo-like organotypic retinal wholemount cultures including dissection peculiarities of embryonic, postnatal and adult murine eyes and (2) a dissociation and cytospin procedure for analysis of neuronal apoptosis and retinal cell proliferation in organotypic wholemounts, e.g. after culture in the presence of exogenously applied recombinant factors.

In vivo-like Organotypic Murine Retinal Wholemount Culture

This video article demonstrates the establishment of organotypic retinal wholemount cultures and a cytospin procedure for analysis of exogenously induced effects. Organotypic retinal wholemount cultures mimic the in vivo situation and significantly facilitate the accessibility of murine retinas for experimental manipulations while circumventing the disadvantages of classical murine animal models.

In vivo-ähnlichen Organotypische Murine Retinal Wholemount Kultur

Targeted ablations of genes and analysis of animal models is the classical strategy for enrolling specific retinal gene function. However, transgenic, ...

Biologie

Generation of Human Patient iPSC-derived Retinal Organoids to Model Retinitis Pigmentosa

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority of RP patients have progressive photoreceptor degeneration leading to peripheral vision loss, night blindness, and finally, total blindness. To date, thousands of mutations in more than 90 genes have been reported to be associated with RP. Currently, there are few animal models available for all the affected genes and different types of mutations, which largely hampers the deciphering of the mechanisms underlying the gene/mutation pathology and limits treatment and drug development. Patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids (ROs) have provided a better system to model the human early-onset disease than cells and animals. In order to study RP, those patient-derived 3D retinal organoids were utilized to recapitulate the clinical phenotypes of RP. In the RP patient-derived ROs, Rhodopsin mislocalization was clearly displayed. Compared with other animal models, patient iPSC-derived retinal organoid models more closely recapitulated RP features and represent an ideal approach for investigating the disease pathogenesis and for drug development.

<meta charset="utf8"></head><body>Generierung von iPSC-abgeleiteten Netzhaut-Organoiden für menschliche Patienten zur Modellierung von Retinitis pigmentosa

In this protocol, retinitis pigmentosa patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids were generated. Those organoids successfully recapitulated some clinical phenotypes of the retinitis pigmentosa disease.

Generierung von iPSC-abgeleiteten Netzhaut-Organoiden für menschliche Patienten zur Modellierung von Retinitis pigmentosa

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Charakterisierung einer neuartigen humanen organotypischen Netzhautkulturtechnik

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Medizin

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent protein kinase (PKG) pathway in photoreceptor cells causes photoreceptor cell death, especially in models harboring phosphodiesterase 6b (PDE6b) mutations. Previous studies on RD have used mainly murine models such as rd1 or rd10 mice. Given the genetic and physiological differences between mice and humans, it is important to understand to which extent the retinas of primates and rodents are comparable. Macaques share a high level of genetic similarity with humans. Therefore, wild-type macaques (aged 1-3 years) were selected for the in vitro culture of retinal explants that included the retina-retinal pigment epithelium (RPE)-choroid complex. These explants were treated with different concentrations of the PDE6 inhibitor zaprinast to induce the cGMP-PKG signaling pathway and simulate RD pathogenesis. cGMP accumulation and cell death in primate retinal explants were subsequently verified using immunofluorescence and the TUNEL assay. The primate retinal model established in this study may serve for relevant and effective studies into the mechanisms of cGMP-PKG-dependent RD, as well as for the development of future treatment approaches.

Retinal explants obtained from wild-type macaques were cultured in vitro. Retinal degeneration and the cGMP-PKG signaling pathway was induced using the PDE6 inhibitor zaprinast. cGMP accumulation in the explants at different zaprinast concentrations was verified using immunofluorescence.

Organotypische retinale Explantatkulturen von Makakenaffen

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

Netzhautexplantat der adulten Mausnetzhaut als Ex-vivo-Modell zur Untersuchung neurovaskulärer Netzhauterkrankungen

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Charakterisierung und morphologische Dynamik von kultiviertem primärem murinem RPE

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important retinal diseases, such as age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and diabetic retinopathy. We present a streamlined approach for the isolation of RPE from murine adult eyes. In contrast to previously reported methods, this approach enables the isolation and culture of highly pure RPE from adult mice. This simple and fast method does not require extensive technical skill and is achievable with basic scientific tools and reagents. Primary RPE are isolated from C57BL/6 background mice aged 3- to 14-weeks by enucleation of the eye followed by the removal of the anterior segment. Enzymatic trypsinization and centrifugation are used to dissociate and isolate the RPE from the eyecup. In conclusion, this approach offers a quick and effective protocol for the utilization of RPE in the study of retinal function and disease.

Autor im Rampenlicht: Effiziente Isolierung von primären retinalen Pigmentepithelzellen aus adulten Mäusen für die Retinopathie-Forschung

Retinal pigment epithelium (RPE) acts as a crucial barrier between the choroid and retina, promoting the health and function of retinal cell types, such as photoreceptors. Herein, we describe a simple and effective protocol for isolating and culturing adult murine RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

Langfristige, serumfreie Kultivierung organotypischer Maus-Retina-Explanten mit intaktem retinalen Pigmentepithel

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Organotypischen Kultur der Full-Dicke ausgewachsenen Schweinen Retina

Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen auf einem Ex Vivo Modell der alten menschlichen Bruch-Membran

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

In vivo-ähnlichen Organotypische Murine Retinal Wholemount Kultur

Generierung von iPSC-abgeleiteten Netzhaut-Organoiden für menschliche Patienten zur Modellierung von Retinitis pigmentosa

Generierung von iPSC-abgeleiteten Netzhaut-Organoiden für menschliche Patienten zur Modellierung von Retinitis pigmentosa

Charakterisierung einer neuartigen humanen organotypischen Netzhautkulturtechnik

Organotypische retinale Explantatkulturen von Makakenaffen

Netzhautexplantat der adulten Mausnetzhaut als Ex-vivo-Modell zur Untersuchung neurovaskulärer Netzhauterkrankungen

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen