Diese Forschungsarbeiten wurden von der Europäischen Union finanziell unterstützt (transMed; H2020-MSCA-765441), der Deutsche Forschungsrat (DFG; PA1751/8-1, 10-1) und dem China-Stipendienrat.

Tierprotokolle, die dem Tierschutzgesetz nr. 4 entsprechen, wurden vom Tübinger Tierschutzausschuss überprüft undgenehmigt. Registrierungs-Nr. AK02/19M). In dieser Studie wurden Netzhaut von Wildtyp-Mäusen (WT) und Rd1-Mäusen gewonnen, wobei letztere ein gut charakterisiertes Modell für die erbliche Netzhautdegeneration15waren. Mäuse wurden unter weißer zyklischer Standardbeleuchtung untergebracht, hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser und wurden unabhängig vom Geschlecht verwendet.
1. Checkliste
<ol><li>Um sterile Bedingungen zu gewährleisten und Verunreinigungen zu vermeiden, reinigen und desinfizieren Sie die laminare Luftstromhaube mit 70% Ethanol. Achten Sie darauf, das Ethanol vollständig verdampfen zu lassen, um eine Vergiftung der Netzhautkulturen zu verhindern.</li>
	<li>Autoklavwerkzeuge (z. B. Schere, Zange und ophthalmologischer Mikroskop-Schrumpflöffel) vor dem Gebrauch.</li>
	<li>Bereiten Sie folgende Medien im Voraus unter einer laminaren Stromhaube unter sterilen Bedingungen vor: Basal R16 medium (BM) (kann 4 Wochen bei 4 °C gelagert werden), BM mit 20% fetalem Kalbsserum (FCS) (am selben Tag), BM mit 0 .12% Proteinase K (44 mAnson U/mg) Lösung (Am selben Tag) und komplettes R16-Medium mit Ergänzungen (CM) wie von Romijn16 beschrieben (kann bei 4 °C für 3 Wochen gelagert werden) (siehe Tabellen S1, S2 und S3).</li>
	<li>Die Proteinase-K-Lösung bei 37 °C vorheizen, um sie zu aktivieren und in Schritt 2.5 zu verwenden.</li>
</ol>2. Vorbereitung
<ol><li>Opfern rd1/WT Tier am postnatalen Tag (P) 5 durch Enthauptung. Für Tiere, die älter als P11 sind, verwenden Sie CO2 und/oder Zervixdislokation gemäß den örtlichen Tierschutzbestimmungen.</li>
	<li>Je nach Alter des Tieres, vor der Enukleation, bei Bedarf, öffnen Sie die Augenlider mit Zangen und sehr sorgfältig trennen Sie die Augenlider, ohne das Auge unten zu berühren oder zu kratzen.</li>
	<li>Die Augen unter einem Stereoskop mit gekrümmten Zangen schnell enukleieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Augen in BM für 5 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Augen in vorgewärmtem BM, mit 0,12% Proteinase K bei 37 °C für 15 min.</li>
	<li>Führen Sie die folgenden Schritte in einer laminaren Luftstromhaube aus, um sterile Bedingungen zu gewährleisten. Um Proteinase K zu inaktivieren, übertragen Sie die Augen auf BM, die 20% FCS enthalten, und inkubieren Sie für 5 min bei RT.</li>
	<li>Sezieren Sie die Augen unter einem Stereoskop, aseptisch, in einer Petrischale mit frischem BM bei RT. Initiieren Sie die Sezierung so schnell wie möglich nach der Enukleation. Je länger diese Zeit ist, desto schwieriger ist es, die Netzhaut zu sezieren, die Augen werden sehr weich.<ol>
<li>Halten Sie mit Einer Zange das Auge vom Sehnerv. Mit einer feinen Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt in der Hornhaut, wo 2 Kanten, von wo die Hornhaut, die Aderundin und die Sklera sanft geschält werden können mit 2 Paar feinen Zangen(Abbildung 1 Schritte A-C). Alternativ können Sie eine Schmalspurkanüle verwenden, um einen ersten Schnitt in die Hornhaut zu machen, und dann eine der Scherenklingen in die Öffnung einsetzen.</li>
		<li>Greifen Sie die Linse mit feiner Zange. Platzieren Sie ein zweites Zangenpaar senkrecht zu den ersten, so dass sich die ersten Zangen zwischen den beiden Schaften des zweiten befinden. Ziehen Sie, um die Linse aus der Augenschale zu extrahieren. Wenn der Glaskörper und der Ziliarkörper noch an der Netzhaut befestigt sind, entfernen Sie sie sorgfältig(Abbildung 1 Schritt D). HINWEIS: Die Schritte 2.7.1 und 2.7.2 müssen geübt werden und achten Sie darauf, dass die Netzhaut nicht beschädigt wird.</li>
		<li>Schneiden Sie die Netzhaut senkrecht zu ihren Rändern in vier Punkte, wodurch eine vierblättrige Kleeform entsteht(Abbildung 1 Schritte E–F).</li>
		<li>Mit einer Pipette mit breit geschnittener Basis einer 1 ml Spitze die Netzhaut in einem hängenden Tropfen des Mediums halten und in einen Kulturschalenfiltereinsatz übertragen, der in eine 6-Well-Kulturplatte gelegt wird. Die RPE-Schicht sollte der Membran gegenüberstehen(Abbildung 1 Schritt G).</li>
		<li>Entfernen Sie mit einer Pipette vorsichtig das überschüssige Medium aus dem Einsatz.</li>
		<li>Von den Seiten des Brunnens 1 ml CM pro Brunnen hinzufügen und in einem sterilen Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2brüten. Tauchen Sie die Netzhaut nicht in das Medium, da dies die Sauerstoffversorgung reduziert und Gewebedegeneration verursacht. Die Explantation sollte an der Schnittstelle zwischen Flüssigkeit und Luft bleiben, nur durch einen dünnen Flüssigkeitsfilm bedeckt, der durch die Oberflächenspannung von Wasser erzeugt wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lassen Sie die Netzhautexplantation für die ersten 48 h ungestört, um die Genesung nach dem Explantationsverfahren zu erleichtern.</li>
	<li>Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag (48 h). Entsorgen Sie 700 l Medium aus jedem Brunnen und fügen Sie 900 l frischen CM in den Brunnen. Auf diese Weise wird die Menge des durch Verdunstung verlorenen Mediums wiederhergestellt und die Netzhautexplantation behält einige der neuroprotektive Faktoren, die in den vorherigen 48 h produziert wurden.</li>
	<li>Inkubieren Sie das entfernte Medium in einem separaten und geschlossenen Mikrozentrifugenrohr zusammen mit den Kulturen, um mögliche Verunreinigungen zu kontrollieren und zu bewerten (d. h. Farbänderung des Mediums). HINWEIS: Netzhaut-Expflanzen können in Kultur für mindestens 2 Wochen gehalten werden12.</li>
</ol>3. Nach der Kultivierung
HINWEIS: Explanten können für verschiedene experimentelle Anwendungen (Westlicher Fleck, Histologie, ganze Reittiere, genetische Analyse, Elektrophysiologie) verwendet werden. Je nach Anwendung können organotypische Netzhautexpflanzen eingefroren, lysiert oder für die Kryosektion vorbereitet werden. Die folgenden Schritte beschreiben die histologische Vorbereitung.
<ol><li>Führen Sie eine 45-min-Fixierung mit 4% Paraformaldehyd (PFA), gefolgt von allmählichem Saccharose-Kryoschutz (10% Saccharose für 10 min, 20% für 20 min und 30% für 2 h bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht (ON) bei 4 °C). Fügen Sie diese Puffer direkt in den Brunnen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Membran um die retinalen Explanten.</li>
	<li>Einbetten sowohl der Membran als auch des Netzhautgewebes in das Medium für gefrorenes Gewebe.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Abbildung 1:Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Herstellung organotypischer netzretinaler Explantationskulturen. (A) Mausaugen werden enukleiert und auf eine Lösung der Proteinase K übertragen, um die Trennung von Sklera und Aderhaut von der Netzhaut und RPE zu ermöglichen. Ein kleiner Schnitt in der Sklera/Choroidschicht wird eingeführt. (B) Zwei Zangen werden verwendet, um die Sklera/Choroidschicht zu schälen. (C) Die schwarze Aderhautschicht ist während des Peelings zu sehen. Das unterlegende dunkle retinale Pigmentepithel (RPE) bleibt am Augapfel befestigt. Die Sklera und Die Aderhaut werden zusammen mit dem Sehnerv entfernt. (D) Die Linse und der Glaskörper werden mit Zangen extrahiert.  Der verbleibende Ziliarkörper wird entfernt. (E) Die Netzhaut behält eine schüsselartige Form. (F) Um die Netzhaut für die Kultivierung in einer Schale abzuflachen, werden 4 Schnitte in gleichem Abstand um die Netzhaut mit einer Schere gemacht, was ihr eine kleeähnliche Form verleiht. Die Netzhautkultur wird mit hilfe einer geschnittenen 1 ml Pipettenspitze auf einen Membrankultureinsatz in einer 6-Well-Platte übertragen. Die Netzhaut behält noch einen Teil der Schalenform. Bei Entfernung der überschüssigen Flüssigkeit, die die Netzhaut umgibt, entfaltet sie sich jedoch zu einer planaren Struktur. (G) Im Kulturmembranaufbau ruht die Netzhautkultur auf einer porösen Polycarbonatmembran (PC) auf einer Lösung des kompletten R16-Mediums. Um die Lebensfähigkeit zu gewährleisten, muss die Kultur in einem befeuchteten sterilen Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2gehalten werden, und das Medium sollte alle 48 h ausgetauscht werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das vorgestellte Protokoll beschreibt organotypische Explantienkulturen der Mausnetzhaut mit intaktem RPE in definiertem R16-Medium, frei von Serum und Antibiotika. Dieses Protokoll wurde ursprünglich in den späten 1980er Jahrenentwickelt 7,28 und seitdem wurde es kontinuierlich verfeinert6,11,12. Bemerkenswerte Anwendungen sind Studien über die Mechanismen der erblichen Netzhautdegeneration und die Identifizierung von retinoprotektive Medikamente23,29,30.
Für ein erfolgreiches Experiment müssen einige wichtige Überlegungen berücksichtigt werden. Hier sind einige wichtige Fehlerbehebungspunkte, um die Qualität der Kulturen zu verbessern. Erstens können die Netzhautkulturen übermäßige Faltung und/oder Rosettenbildungzeigen 31. Dies kann durch Berühren der Netzhaut mit einer Zange während des Explantationsvorgangs verursacht werden. Darüber hinaus muss der Ziliarkörper vollständig aus der Explantation entfernt werden, da dies die Netzhautfaltung während der Kultur erhöhen kann. Zweitens, während der Übertragung der Netzhaut auf die Brunnenplatte in einem hängenden Tropfen, wenn die Netzhaut der Membran die falsche Seite nach unten zeigt, halten Sie es in den Tropfen hängen an der Pipette Spitze und sehr sanft drücken Sie das Medium in und aus der Spitze (ohne den hängenden Tropfen zu lösen), um die Netzhaut umzudrehen. Schließlich, wenn das RPE an der Sklera befestigt bleibt und sich von der Netzhaut löst, wird es höchstwahrscheinlich durch eine unzureichende Präverdauung der Sklera verursacht. Dieses Problem kann besonders wichtig sein, wenn es mit Augen älterer Tiere oder Nicht-Nagetierarten (z. B. Schweine) arbeitet und durch Erhöhung der Proteinase-K-Konzentration gelöst werden kann.
Die Durchführung organotypischer Netzhautexplantationskulturen ist ein komplexes Verfahren, das eine angemessene Ausbildung und Erfahrung erfordert. Mangelndes Training kann zu Einer Variabilität der Qualität der Netzhautexplantationen führen. Aus diesen Gründen ist es wichtig, die Lebensfähigkeit und Reproduzierbarkeit zu überwachen und zu überprüfen, indem beispielsweise die Rate des Zelltodes mit dem TUNEL-Assay charakterisiert wird. Der Einsatz eines antibiotikafreien Mediums macht die Netzhautexplantationen anfällig für eine Kontamination durch Bakterien und Pilze. Um dieses Risiko zu minimieren, empfehlen wir, besonders darauf zu achten, unter wirklich aseptischen Bedingungen zu arbeiten. Eine weitere Einschränkung der in vitro retinalen Kultivierung sind Unterschiede in der physiochemischen Umgebung im Vergleich zur in vivo Netzhaut (z. B. Aderhaut- und Netzhautblutversorgung, Sauerstoff- und Glukosespiegel, Augeninnendruck, Zusammensetzung des Glaskörpers). Ein kontinuierliches Perfusionssystem, das vielleicht in einen speziellen Bioreaktor32 eingebettet ist, könnte dieses Modell näher an den In-vivo-Zustand bringen. Darüber hinaus führt die Axotomie des Sehnervs während der Netzhautsektion zum Tod von Ganglienzellen, die Stressreaktionen induzieren können8. Daher ist es empfehlenswert, dass das Explant mindestens 2 Tage in vitro an Kultivierungsbedingungen angepasst werden muss, bevor es einer spezifischen Manipulation oder Behandlung unterzogen wird.
Die beschriebene Methode wird in der Regel auf unreife Netzhautgewebe durchgeführt, die gut überleben können für 4 Wochen in vitro7,33. Das Verfahren ist jedoch auf eine Vielzahl von Anwendungen zugeschnitten, einschließlich der Kultivierung der adulten Netzhaut. Obwohl verschiedene veröffentlichte Ansätze die Isolierung der adulten Netzhaut ohne ihre RPE34,35beschreiben, ermöglicht die Inkubation mit Papainlösung für bis zu 1 h bei 37 °C vor der Zerlegung, dass das RPE an der Netzhaut befestigt bleibt, selbst wenn es von einer erwachsenen Maus abgeleitet ist36.
Das serumfreie Medium und die chemisch definierte In-vitro-Umgebung sorgen für eine vollständig definierte und reproduzierbare Manipulation der Versuchsbedingungen. Daher sind organotypische netzhaut-Explantationskulturen wertvolle Werkzeuge auf dem Gebiet der Ophthalmologie und Neurowissenschaften und wurden für die Untersuchung von Netzhauterkrankungen37, Netzhautentwicklung38,39, Netzhautstammzelltherapie40, genetische Modifikationen41und pharmakologisches Screening verwendet. Als spezifisches Beispiel für Arzneimitteltests haben wir hier retinale Explantationskulturen verwendet, um ein cGMP-Analogon (CN003) zu testen, bekannt, um den Tod von Photorezeptorzellen in Tiermodellen für vererbte Netzhauterkrankungen zu reduzieren23 (Abbildung 3B). Eine weitere mögliche Anwendung der Technik wird in Abbildung 3Cbeschrieben, die zeigt, wie die präzise Kontrolle der Gewebeumgebung genutzt werden kann, um diabetische Bedingungen zu emulieren24. Aufgrund der Erhaltung der Gewebearchitektur über die gesamte Kultivierungsperiode eignen sich organotypische Netzhautexplantationskulturen auch für elektrophysiologische Studien. Neuronale Funktionalität auf retinalen Explants wurden mit Patch-Clamp-Aufnahme42 und Multi-Elektroden-Array (MEA) Aufzeichnung33,43untersucht. Letzteres ermöglicht die gleichzeitige Erfassung der elektrischen Aktivität neuronaler Populationen und wurde genutzt, um die Funktionalität von Photorezeptor- und Ganglienzellen unter Kulturbedingungen zu charakterisieren. In einer breiteren Perspektive können die organotypischen Explantenkultursysteme auch in der präklinischen Forschung angewendet werden, wo Explantienkulturen verwendet wurden, um die therapeutische Wirksamkeit der Hypothermie zu testen44.
Die organotypische Explant-Kultivierungstechnik ist relativ einfach durchzuführen und im Vergleich zu entsprechenden In-vivo-Experimenten kostengünstiger und zeitaufwändiger und vermeidet die ethischen Bedenken im Zusammenhang mit Studien lebender Tiere. Die präzise Kontrolle der experimentellen Bedingungen und die Erhaltung der RPE- und Gewebekomplexität machen die Methode zu einem wertvollen Werkzeug, um unser Wissen über Netzhautphysiologie und Pathophysiologie zu verbessern und zahlreiche experimentelle Anwendungen zu ermöglichen.

In der ophthalmologischen Forschung stehen eine Vielzahl von Modellen zur Verfügung, um die Netzhaut zu untersuchen, einschließlich primärer Netzhautzellkulturen, retina-abgeleiteter Zelllinien, retinaler Organoide und in vivo Tiermodelle1,2,3,4,5. Jedes dieser Modelle leidet jedoch unter Nachteilen. Zum Beispiel wachsen Zellen isoliert, während die Netzhaut ein komplexes Netzwerk mit einer Vielzahl von Zell-zu-Zell-Interaktionen ist. Daher ist das Verhalten isolierter Zellkulturen wahrscheinlich künstlich im Vergleich zu dem, das in einem ganzen Gewebe beobachtet wird. Dieses Problem kann zum Teil mit in vitro differenzierten Retina-Organoiden behoben werden, die verwendet werden können, um Entwicklung und grundlegende Biologie zu studieren6. Dennoch ist die Retinal-Organoid-Generation bis heute zeitaufwändig, arbeitsintensiv und leidet unter Reproduzierbarkeitsproblemen, die umfangreiche Weiterentwicklungsarbeit erfordern, bevor Organoide für die translationale Netzhautforschung verwendet werden können. Schließlich sind Studien an lebenden Tieren, obwohl das Modell, das den Anforderungen der ophthalmologischen Forschung am nächsten kommt, mit starken ethischen Bedenken verbunden. Ein guter Kompromiss zwischen der Effizienz von Zellkultursystemen und der realen Situation von in vivo Tiermodellen sind organotypische Netzhautexplantationskulturen. Solche Kulturen reduzieren auch das Leiden der Tiere, da keine In-vivo-Interventionen durchgeführt werden.
Es wurden mehrere Methoden zur Kultivierung von Retinalen Expflanzen verschiedener Arten5,7,8beschrieben. Unser Protokoll beschreibt eine Technik zur Isolierung der Mausneuroretina zusammen mit ihrem retinalen Pigmentepithel (RPE). Diese Technik wird auch für Ratte Netzhautkulturen9geeignet sein. Die Kultur der Neuroretina zusammen mit ihrem RPE ist von großer Bedeutung für den Erfolg. Das RPE erfüllt wesentliche Funktionen für die Netzhaut: Transport von Nährstoffen, Ionen, Wasser, Absorption von Licht und Schutz vor Photooxidation, Re-Isomerisierung von All-Trans-Retinal in 11-cis-retinal, was für den visuellen Zyklus entscheidend ist, Phagozytose von Schuppen photorezeptormembranen, und Sekretion von wesentlichen Faktoren für die strukturelle Integrität der Netzhaut10. Die Aufrechterhaltung des RPE ermöglicht eine erfolgreiche Entwicklung von Photorezeptor-Außen- und Innensegmenten, wodurch die Netzhaut länger lebensfähig bleibt11. Das unten beschriebene Verfahren bewahrt die histotypischen und physiologischen Eigenschaften der Netzhaut für mindestens zwei Wochen12. Darüber hinaus vermeidet die Kultivierung der organotypischen Netzhautexplantationen in serumfreiem, antibiotikafreiem Medium das Vorhandensein unbekannter Substanzen und ermöglicht eine einfache Interpretation der Ergebnisse12.
Organotypische Netzhautexplantationskulturen waren wesentlich für die Verbesserung unseres Wissens über Netzhautentwicklung und Degeneration7,13,14. Wir zeigen hier, dass sie auch ein nützliches Werkzeug für pharmakologisches Screening sind und dass sie eingesetzt werden können, um eine Vielzahl von Netzhauterkrankungen zu modellieren, einschließlich diabetischer Retinopathie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+/-)-&#945;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDP-Choline-Na</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &#215; 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&#181;m</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3942.101</td>
			<td>for Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-CysteineHCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 x 4H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaSeO3 x 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>10360-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>21935025</td>
			<td>44 mAnson U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>07491252A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.22&#181;m</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>for supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopherylacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

In der ophthalmologischen Forschung besteht ein starker Bedarf an In-vitro-Modellen der Neuroretina. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur organotypischen Kultivierung der Mausneuro-Retina mit intaktem retinalen Pigmentepithel (RPE) vor. Je nach Forschungsfrage können Netzhaut von Wildtieren oder von Krankheitsmodellen isoliert werden, um beispielsweise diabetische Retinopathie oder erbliche Netzhautdegeneration zu untersuchen. Die Augen vom frühen postnatalen Tag 2 bis 9 Tiere werden unter aseptischen Bedingungen enukleiert. Sie werden teilweise in Proteinase K verdaut, um eine Ablösung der Aderhaut vom RPE zu ermöglichen. Unter dem Stereoskop wird ein kleiner Schnitt in der Hornhaut gemacht, wo zwei Kanten entstehen, von denen die Aderhaut und Sklera sanft von der RPE und Neuroretina abgeschält werden können. Die Linse wird dann entfernt, und die Augenmuschel wird in vier Punkte geschnitten, um ihr eine vierkeilige Form zu geben, die einem Kleeblatt ähnelt. Das Gewebe wird schließlich in einem hängenden Tropfen in einen Zellkultureinsatz mit einer Polycarbonat-Kultivierungsmembran übertragen. Die Kulturen werden dann in R16 medium, ohne Serum oder Antibiotika, unter vollständig definierten Bedingungen, mit einer mittleren Veränderung jeden zweiten Tag gepflegt.
Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Isolierung der Netzhaut und die Erhaltung ihres normalen physiologischen und histotypischen Kontextes für Kultivierungsperioden von mindestens 2 Wochen. Diese Eigenschaften machen organotypische Netzhautexplantationskulturen zu einem ausgezeichneten Modell mit hohem Vorhersagewert für Studien zur Netzhautentwicklung, Zustände und Elektrophysiologie und ermöglichen gleichzeitig ein pharmakologisches Screening.

Nach dem Befolgen des Protokolls bewahren sezierte und kultivierte Netzhautexplanten ihre normale Gewebearchitektur mit unterschiedlichen Schichten, vom RPE bis zur Ganglienzellschicht (GCL), wie in Abbildung 2dargestellt. Die Größe der äußeren Kernschicht (ONL) und der inneren Kernschicht (INL) blieb 2-3 Wochen lang weitgehend stabil, wobei ein langsam fortschreitender Zellverlust und eine allmähliche Ausdünnung dieser Schichten immer deutlicher werden, wenn die Kultivierungszeit auf 4 Wochen und darüber hinaus verlängert wird. Im GCL hingegen wird aufgrund der Axotomie des Sehnervs in der Regel innerhalb der ersten 4 Tage der Kultivierung eine deutliche Ausdünnung beobachtet. Danach wird die verbleibende Zellpopulation in der GCL (meist verdrängte Amacrine-Zellen) für weitere 3-4-Wochen17,18,19lebensfähig bleiben.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Abbildung 2:Zelltypen, die in derretinalen Explantationskultur gefunden werden. Netzhautexplantationskultur bei P11 abgeleitet von rd1 Mutant (A) und WT-Tieren (B) zeigt nukleare Färbung mit DAPI (links, blau), Stab-Photorezeptoren (Mitte, rot) und Müller-Zellen (rechts, grün). Die Kernfärbung hebt alle wichtigen zellulären Schichten der Netzhaut hervor, wie z. B. retinalepigmentepithel (RPE), äußere Kernschicht (ONL), innere Kernschicht (INL) und Ganglienzellschicht (GCL). Spezifische Zelltypen in den Kernschichten, wie Z.B. Stäbe und Müller-Zellen, sind immunlabeliert mit Alpha-Arrestin26 bzw. Glutamin-Synthetase-27-Antikörpern. (C) Zeigt den gesamten Abschnitt einer ganzen   rd1-Maus-Retina mit DAPI-Färbung an, die die Konsistenz, Integration und Entwicklung der Netzhaut hervorhebt. Diese Netzhaut wurde für 6 Tage kultiviert. Verfahrensbeschreibung: Retina und RPE, abgeleitet von rd1 oder WT-Tieren, wurden bei P5 isoliert und, wie im Protokoll beschrieben, bis P11 mit einer mittleren Veränderung alle 48 h kultiviert. Kulturen wurden mit 4% PFA bei P11 fixiert und kryosectioniert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen</a>
Serumfreies Medium und die nachhaltige In-vitro-Umgebung ermöglichen die volle Kontrolle über die experimentellen Bedingungen. Hier stellen wir zwei Beispiele für spezifische Anwendungen dieses Protokolls bereit. Das erste Beispiel veranschaulicht die Möglichkeit, Netzhautexplantationen für Arzneimitteltests oder Screening-Zwecke zu verwenden. Organotypische Netzhautexplantationskulturen wurden aus Wildtyp-(WT) und rd1-Mausmodellen hergestellt. Letzteres ist ein gut charakterisiertes Modell für die Netzhautdegeneration15. In der rd1 MausNetzhaut wird die ONL-Degeneration durch ungewöhnlich hohe cGMP-Werte in Stabphotorezeptoren6,20ausgelöst. Übermäßige cGMP verursacht erhöhte Aktivität von zyklischen Nukleotid-Gated-Ionen-Kanälen (CNGCs) und cGMP-abhängiger Proteinkinase (PKG), was zum Zelltod21führt. Die Behandlung von rd1-Mausnetzhaut mit einem strukturellen Analog zu cGMP (zyklisches Nukleotid #3; CN003), das sowohl auf PKG als auch auf CNGC abzielt, wurde getestet. Nach der Explantation bei P5 wurde das in Abbildung 3A beschriebene Behandlungsparadigma befolgt. Die Explantkulturen wurden mit 4% PFA bei P11 fixiert und für die Kryosektion vorbereitet (Abbildung 3A). Zur Beurteilung des Zelltodes von histologischen Abschnitten aus behandelten, nicht behandelten (NT) und WT-Proben wurde ein terminaler Desoxynukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) Assay22 durchgeführt. Die Analyse von TUNEL-markierten Zellen zeigte einen hohen Anteil sterbender Zellen im ONL der rd1 unbehandelten Proben, während CN003-geschützte rd1-Mausphotorezeptoren bei einer Konzentration von 50 m23 (Abbildung 3B) aufgetragen wurden.
Eine häufige Komplikation von Diabetes ist die diabetische Retinopathie, eine blendende Krankheit, die in Tiermodellen nur schwer originalgetreu zu reproduzieren ist5. Das zweite Beispiel zeigt die Verwendung von organotypischen retinalen Explant-Kulturen zur Charakterisierung der Lebensfähigkeit der Netzhautzellen unter Bedingungen, die Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM)24emulieren. Hier haben wir 20 mM des Glykolyseinhibitors 2-Deoxy-Glucose (2-DG)25 verwendet und 24 h von P10 bis P11 an das Kulturmedium verabreicht. Wir zeigen, dass die Unterwerung von WT-Retina-Explantationen solchen in vitro simulierten diabetischen Erkrankungen zu einem umfangreichen neuronalen Zelltod der Netzhaut führt (Abbildung 3C). Dieses Paradigma wiederum kann dann zum Beispiel verwendet werden, um degenerative Mechanismen zu studieren oder retinoprotektive Behandlungen in einem Diabetes-Kontext zu testen.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Abbildung 3: Zwei Beispiele für Anwendungen organotypischer netzretinaler Explantationskulturen. (A) Verfahrensbeschreibung: Retina und RPE abgeleitet von rd1 oder WT-Tieren wurden am postnatalen Tag (P) 5 isoliert und wie oben beschrieben kultiviert, mit einer mittleren Veränderung alle 48 h. Bei P7 und P9 wurde das verbrauchte Medium verworfen und frischecm mit Wirkstoff in einer Konzentration von 50 m auf die Platte gesetzt. Kulturen wurden mit 4% PFA bei P11 fixiert und kryosectioniert. (B) Compound-Tests an der netzretina rd1. Abschnitte wurden aus WT, behandelt (003) und nicht behandelten (NT) organotypischen retinalen Explantationskulturen gewonnen. TUNEL Assay (rot) wurde als Marker für den Zelltod verwendet. Nukleare Färbung mit DAPI (blau). Die im Balkendiagramm dargestellte Quantifizierung veranschaulicht die Prozentsätze sterbender Zellen in WT, rd1 NT und rd1 003 Zustand. Die Behandlung mit Verbindung 003 reduzierte den Tod von rd1 Photorezeptorzellen signifikant. (C) Simulation von Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) auf der WT-Retina mit 2-Deoxy-Glucose (2-DG) Behandlung. DER TUNEL-Assay wurde an NT- und T2DM-Proben durchgeführt. Die Quantifizierung deutet auf einen sehr signifikanten Anstieg des Zelltodes hin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen</a>
Tabelle S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um die Tabelle herunterzuladen</a>  
Tabelle S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um die Tabelle herunterzuladen</a>  
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Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Das Protokoll beschreibt organotypische Explanten der Maus NeuroRetina, kultiviert zusammen mit seinem retinalen Pigment epithel (RPE), in R16 definierten Medium, frei von Serum und Antibiotika. Diese Methode ist relativ einfach durchzuführen, im Vergleich zu In-vivo-Experimenten kostengünstiger und zeitaufwändigund und kann an zahlreiche experimentelle Anwendungen angepasst werden.

Langfristige, serumfreie Kultivierung organotypischer Maus-Retina-Explanten mit intaktem retinalen Pigmentepithel

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

long-term-serum-free-cultivation-organotypic-mouse-retina-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Aufrufe.  University of Tübingen. Das Protokoll beschreibt organotypische Explanten der Maus NeuroRetina, kultiviert zusammen mit seinem retinalen Pigment epithel (RPE), in R16 definierten Medium, frei von Serum und Antibiotika. Diese Methode ist relativ einfach durchzuführen, im Vergleich zu In-vivo-Experimenten kostengünstiger und zeitaufwändigund und kann an zahlreiche experimentelle Anwendungen angepasst werden.

Serie: Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Präparation einer Maus Eye für einen ganzen Berg von retinalen Pigmentepithel

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human retina and is therefore a valuable species for studying mechanisms of human retinal injury and degenerative disease. Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina isolated from eyes obtained from an abattoir. After removing the anterior segment, a trephine blade was used to create multiple neural retina-Bruch's membrane-RPE-choroid-sclera explants from the posterior segment of adult porcine eyes. A piece of sterile filter paper was used to lift the neural retina off from each explant. The filter paper-retina complex was cultured (photoreceptor side up) atop an insert, which was held away from the bottom of the culture dish by a custom-made stand. The stand allows for good circulation of the culture medium to both sides of the retina. Overall, this procedure is simple, reproducible, and permits preservation of native retinal structure for at least seven days, making it a useful model for a variety of morphological, pharmacological, and biochemical studies on mammalian retina.

Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina for seven days. Briefly, a sterile filter paper was used to lift the neural retina off from the RPE and place photoreceptor side up on an insert raised by a custom-made stand.

Organotypischen Kultur der Full-Dicke ausgewachsenen Schweinen Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

Langfristige sensorischen Konflikt in Mäusen frei Verhalten

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent protein kinase (PKG) pathway in photoreceptor cells causes photoreceptor cell death, especially in models harboring phosphodiesterase 6b (PDE6b) mutations. Previous studies on RD have used mainly murine models such as rd1 or rd10 mice. Given the genetic and physiological differences between mice and humans, it is important to understand to which extent the retinas of primates and rodents are comparable. Macaques share a high level of genetic similarity with humans. Therefore, wild-type macaques (aged 1-3 years) were selected for the in vitro culture of retinal explants that included the retina-retinal pigment epithelium (RPE)-choroid complex. These explants were treated with different concentrations of the PDE6 inhibitor zaprinast to induce the cGMP-PKG signaling pathway and simulate RD pathogenesis. cGMP accumulation and cell death in primate retinal explants were subsequently verified using immunofluorescence and the TUNEL assay. The primate retinal model established in this study may serve for relevant and effective studies into the mechanisms of cGMP-PKG-dependent RD, as well as for the development of future treatment approaches.

Retinal explants obtained from wild-type macaques were cultured in vitro. Retinal degeneration and the cGMP-PKG signaling pathway was induced using the PDE6 inhibitor zaprinast. cGMP accumulation in the explants at different zaprinast concentrations was verified using immunofluorescence.

Organotypische retinale Explantatkulturen von Makakenaffen

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Untersuchung bipolarer und horizontaler neuronaler Zellen in der gespaltenen Netzhaut der Maus

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

Autor im Rampenlicht: Verwendung der Split-Retina-Technik für verbesserten Zugang und beschleunigte Experimente 

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.