Questo lavoro di ricerca ha ricevuto un sostegno finanziario dall'Unione europea (transMed; H2020-MSCA-765441), il Consiglio tedesco delle ricerche (DFG; PA1751/8-1, 10-1) e il Consiglio delle borse di studio per la Cina.

I protocolli sugli animali conformi al §4 della legge tedesca sulla protezione degli animali sono stati esaminati e approvati dal comitato dell'Università di Tubinga per la protezione degli animali(Einrichtung für Tierschutz, Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde; N. registrazione AK02/19M). In questo studio, le retine sono state ottenute da topi di tipo selvatico (WT) e rd1, quest'ultimo è un modello ben caratterizzato per la degenerazione retinicaereditaria 15. I topi erano alloggiati sotto l'illuminazione ciclica bianca standard, avevano libero accesso al cibo e all'acqua e venivano utilizzati indipendentemente dal sesso.
1. Lista di controllo
<ol><li>Per garantire condizioni sterili ed evitare contaminazioni, pulire e disinfettare la cappa di flusso d'aria laminare con il 70% di etanolo. Assicurati di lasciare evaporare completamente l'etanolo, per prevenire l'intossicazione delle colture retiniche.</li>
	<li>Strumenti autoclave (ad esempio forbici, forcette e cucchiaio raschiante al microscopio oftalmico) prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare in anticipo i seguenti supporti sotto una cappa a flusso laminare, in condizioni sterili: Basal R16 medium (BM) (può essere conservato a 4 °C per 4 settimane), BM con siero fetale al polpaccio 20% (FCS) (uso stesso giorno), BM con 0,12% proteinasi K (44 mAnson U/mg) soluzione (stesso uso quotidiano) e mezzo R16 completo con integratori (CM) come descritto da Romijn16 (può essere conservato a 4 °C per 3 settimane) (vedi tabelle S1, S2 e S3).</li>
	<li>Preriscaldare la soluzione di proteinasi K a 37 °C per attivarla e utilizzarla nel passaggio 2.5.</li>
</ol>2. Preparazione
<ol><li>Sacrificio rd1/WT animale nel giorno post-natale (P) 5 per decapitazione. Per gli animali di età superiore a P11, utilizzare CO2 e/o lussazione cervicale, secondo le normative locali sulla protezione degli animali.</li>
	<li>A seconda dell'età dell'animale, prima dell'enucleazione, se necessario, aprire i coperchi degli occhi usando le forcep e separare con molta attenzione i coperchi degli occhi, senza toccare o graffiare l'occhio sottostante.</li>
	<li>Enucleare rapidamente gli occhi sotto uno stereoscopio usando forcep curve.</li>
	<li>Incubare gli occhi in BM per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Incubare gli occhi in BM preriscaldato, con 0,12% proteinasi K a 37 °C per 15 min.</li>
	<li>Eseguire i seguenti passaggi all'interno di una cappa di flusso d'aria laminare per garantire condizioni sterili. Per inattivare la proteinasi K, trasferire gli occhi su BM contenente il 20% di FCS e incubare per 5 minuti presso RT.</li>
	<li>Sezionare gli occhi sotto uno stereoscopio, a livello aettico, in una piastra di Petri contenente BM fresco a RT. Avviare la dissezione il prima possibile dopo l'enucleazione. Più a lungo questa volta è, più difficile è sezionare la retina, gli occhi diventano molto morbidi.<ol>
<li>Con le forcep, tenere l'occhio dal nervo ottico. Usando forbici fini, fare una piccola incisione nella cornea creando 2 bordi da cui la cornea, il coroide e la sclera possono essere delicatamente sbucciati usando 2 paia di forcep fini(Figura 1 passi A-C). In alternativa, utilizzare una cannula a scartamento ridotto per fare una prima incisione nella cornea e quindi inserire una delle lame a forbice nell'apertura.</li>
		<li>Afferrare l'obiettivo con forcep fini. Posizionare una seconda coppia di forcep perpendicolarmente alle prime in modo che le prime forcep siano tra i 2 gambo del secondo. Tirare per estrarre l'obiettivo dalla tazza degli occhi. Se il corpo vitreo e il corpo ciliario sono ancora attaccati alla retina, rimuoverli con attenzione(Figura 1 fase D). NOTA: I passaggi 2.7.1 e 2.7.2 necessitano di pratica e garantiscono cautela per non danneggiare la retina.</li>
		<li>Tagliare la retina perpendicolarmente ai bordi in quattro punti, creando una forma a quadrifoglio(Figura 1 passaggi E-F).</li>
		<li>Utilizzando una pipetta con base ampiamente tagliata di una punta da 1 mL, tenere la retina in una goccia appesa di mezzo e trasferirla in un inserto filtrante per piatti di coltura posto in una piastra di coltura a 6 po porsi. Lo strato RPE deve essere fronte alla membrana(Figura 1 fase G).</li>
		<li>Utilizzando una pipetta, rimuovere con cura il mezzo in eccesso dall'inserto.</li>
		<li>Dai lati del pozzo, aggiungere 1 mL di CM per pozzo e incubare in un incubatore sterile a 37 °C con 5% CO2. Non immergere la retina nel mezzo in quanto ciò ridurrà l'ossigenazione e causerà la degenerazione tissutale. L'espianto deve rimanere all'interfaccia tra liquido e aria, coperto solo da un sottile film di liquido creato dalla tensione superficiale dell'acqua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lasciare indisturbato l'espianto retinale per le prime 48 ore per facilitare il recupero dopo la procedura di espianto.</li>
	<li>Cambiare il mezzo ogni secondo giorno (48 h). Scartare 700 μL di mezzo da ogni pozzo e aggiungere 900 μL di CM fresco al pozzo. In questo modo, la quantità di mezzo persa per evaporazione viene recuperata e l'espianto retinale mantiene alcuni dei fattori neuroprotettivi prodotti nelle precedenti 48 ore.</li>
	<li>Incubare il mezzo rimosso in un tubo di microcentrifugo separato e chiuso insieme alle colture per controllare e valutare la possibile contaminazione (cioè il cambiamento di colore del mezzo). NOTA: Le espianto retiniche possono essere conservate in coltura per almeno 2 settimane12.</li>
</ol>3. Dopo la ristrutturazione
NOTA: Gli espianto possono essere utilizzati per diverse applicazioni sperimentali (western blot, istologia, supporti interi, analisi genetica, elettrofisiologia). A seconda dell'applicazione, le espianto retiniche organotipiche possono essere congelate, litolate o preparate per la criosezione. I passaggi seguenti descrivono la preparazione istologica.
<ol><li>Eseguire una fissazione di 45 minuti con paraformaldeide al 4% (PFA), seguita da una crioprotezione graduale del saccarosio (10% di saccarosio per 10 minuti, 20% per 20 minuti e 30% per 2 ore a temperatura ambiente (RT) o durante la notte (ON) a 4 °C). Aggiungere questi buffer direttamente nel pozzo.</li>
	<li>Tagliare la membrana intorno alle espianto retiniche.</li>
	<li>Incorporare sia la membrana che il tessuto retinale nel mezzo per il tessuto congelato.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig01.jpg"> Figura 1: Procedura passo-passo per la preparazione di colture organotipiche di espianto retino. (A) Gli occhi del topo vengono enucleati e trasferiti in una soluzione di proteinasi K per consentire la separazione di sclera e coroide dalla retina e dall'RPE. Viene introdotto un piccolo taglio nello strato sclera / coroide. (B) Per sbucciare lo strato sclera/coroide vengono utilizzate due forcep. (C) Lo strato di coroide nero può essere visto durante il peeling. L'epitelio pigmentato retinico scuro (RPE) che sottolinea rimane attaccato al bulbo oculare. La sclera e la coroide vengono rimosse insieme al nervo ottico. (D) La lente e il vitreo vengono estratti con forcep.  Il corpo ciliario rimanente viene rimosso. (E) La retina mantiene una forma simile a una ciotola. (F) Per appiattire la retina per la coltivazione in un piatto, 4 tagli a uguale distanza intorno alla retina sono fatti con una forbice, dandogli una forma simile a un trifoglio. La coltura della retina viene trasferita in un inserto di coltura a membrana in una piastra a 6 po porsi con l'uso di una punta di pipetta da 1 mL tagliata. La retina conserva ancora parte della forma a ciotola. Tuttavia, dopo la rimozione del liquido in eccesso che circonda la retina, si svilupperà in una struttura planare. (G) Nella configurazione della membrana di coltura, la coltura della retina è appoggiata su una membrana porosa in policarbonato (PC) sopra una soluzione di mezzo R16 completo. Per garantire la vitalità, la coltura deve essere mantenuta in un incubatore sterile umidificato a 37 °C con 5% CO2e il mezzo deve essere sostituito ogni 48 ore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig01large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa cifra</a>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo presentato descrive colture organotipiche di estipe di retina di topo con RPE intatto in mezzo R16 definito, privo di siero e antibiotici. Questo protocollo è stato originariamente sviluppato a partire dalla fine degli anni '807,28 e da allora è stato continuamenteperfezionato 6,11,12. Tra le applicazioni degne di nota figurano studi sui meccanismi della degenerazione retinica ereditaria e l'identificazione dei farmaci retinoprotettivi23,29,30.
Per un esperimento riuscito, è necessario prendere in considerazione alcune considerazioni importanti. Ecco alcuni importanti punti di risoluzione dei problemi per migliorare la qualità delle culture. In primo luogo, le colture retiniche possono mostrare un'eccessiva piegatura e/o formazione di rosetta31. Ciò può essere causato toccando la retina con una forza durante la procedura di espianto. Inoltre, il corpo ciliario deve essere completamente rimosso dall'espianto, in quanto ciò può aumentare la piegatura retinica durante la coltura. In secondo luogo, durante il trasferimento della retina alla piastra del pozzo in una goccia sospesa, se la retina si affaccia sulla membrana il lato sbagliato verso il basso, tienila nella goccia appesa alla punta della pipetta e spingi molto delicatamente il mezzo in uscita dalla punta (senza staccare la goccia appesa) per capovolgere la retina. Infine, se l'RPE rimane attaccato alla sclera e si stacca dalla retina, è molto probabilmente causato da una predigestione insufficiente della sclera. Questo problema potrebbe essere particolarmente importante quando si lavora con gli occhi di animali più anziani o specie non roditori (ad esempio suini) e può essere risolto aumentando la concentrazione di proteinasi K.
Condurre colture organotipiche di espianto retiniche è una procedura complessa che richiede un'adeguata formazione ed esperienza. La mancanza di formazione può portare alla variabilità nella qualità delle espianto retiniche. Per questi motivi, è importante monitorare e verificare la fattibilità e la riproducibilità, caratterizzando, ad esempio, il tasso di morte cellulare con il saggio TUNEL. L'uso di un mezzo privo di antibiotici rende gli espianto retiniche vulnerabili alla contaminazione da batteri e funghi. Per ridurre al minimo questo rischio, si consiglia di prestare particolare attenzione a lavorare in condizioni veramente asettiche. Un'altra limitazione della coltura retinica in vitro sono le differenze nell'ambiente fisiochimico rispetto alla retina in vivo (ad esempio, apporto di sangue coroio e retinico, livelli di ossigeno e glucosio, pressione intraoculare, composizione del vitreo). Un sistema di perfusione continua, forse incorporato in un bioreattorededicato 32, potrebbe rendere questo modello più vicino alla condizione in vivo. Inoltre, l'assotomia del nervo ottico durante la dissezione retinica porterà alla morte delle cellule gangliari, che può indurre risposte allo stress8. Pertanto, è consigliabile lasciare che l'espianto sia lasciato ad adattarsi alle condizioni di coltura per almeno 2 giorni in vitro prima di essere sottoposto a una manipolazione o a un trattamento specifico.
Il metodo descritto viene solitamente eseguito su tessuti retinali immaturi, che possono sopravvivere bene per 4 settimane in vitro7,33. Tuttavia, la procedura è adattabile a una varietà di applicazioni, tra cui la ristrutturazione della retina adulta. Sebbene diversi approcci pubblicati descrivano l'isolamento della retina adulta senza il suo RPE34,35, l'incubazione con soluzione di papaina per un massimo di 1 h a 37 °C prima della dissezione consente all'RPE di rimanere attaccato alla retina anche se derivato da un topo adulto36.
Il mezzo privo di siero e l'ambiente in vitro definito chimicamente prevedono una manipolazione completamente definita e riproducibile delle condizioni sperimentali. Pertanto, le colture organotipiche di espianto retiniche sono strumenti preziosi nel campo dell'oftalmologia e delle neuroscienze e sono state utilizzate per lo studio delle malattie retiniche37,lo sviluppo della retina38,39,la terapia delle cellule staminali retiniche40,le modifichegenetiche 41e lo screening farmacologico. Come esempio specifico di test farmacologici, qui abbiamo usato colture di espianto retinale per testare un analogo cGMP (CN003), noto per ridurre la morte cellulare del fotorecettore nei modelli animali per la malattia retinicaereditaria 23 (Figura 3B). Un'altra possibile applicazione della tecnica è descritta nella figura 3C, che illustra come il controllo preciso dell'ambiente tissutale possa essere sfruttato per emulare le condizioni diabetiche24. A causa della conservazione dell'architettura tissutale durante l'intero periodo di coltura, le colture organotipiche di espianto retinico sono adatte anche per studi elettrofisiologici. La funzionalità neuronale sulle espianto retiniche è stata studiata utilizzando la registrazione patch-clamp42 e la registrazione multi-elettrodo-array (MEA)33,43. Quest'ultimo consente la registrazione dell'attività elettrica delle popolazioni neuronali allo stesso tempo ed è stato sfruttato per caratterizzare la funzionalità del fotorecettore e della cellula ganglionaria in condizioni di coltura. In una prospettiva più ampia, i sistemi di coltura organotipica delle espianto possono essere applicati anche nella ricerca pre-clinica, dove le colture di espianto sono state utilizzate per testare l'efficacia terapeutica dell'ipotermia44.
La tecnica di coltivazione organotipico delle espianto è relativamente semplice da eseguire e, rispetto ai corrispondenti esperimenti in vivo, è meno costosa e dispendiosa in termini di tempo ed evita le preoccupazioni etiche legate agli studi sugli animali vivi. Il controllo preciso sulle condizioni sperimentali e la conservazione della complessità dell'RPE e dei tessuti rendono il metodo uno strumento prezioso per migliorare le nostre conoscenze sulla fisiologia retinica e la fisiopatologia e consentire numerose applicazioni sperimentali.

Nella ricerca oftalmica, sono disponibili una varietà di modelli per studiare la retina, tra cui colture primarie di cellule retiniche, linee cellulari derivate dalla retina, organoidi retinali e modelli animali in vivo1,2,3,4,5. Tuttavia, ognuno di questi modelli soffre di svantaggi. Ad esempio, le cellule crescono in isolamento mentre la retina è una rete complessa con una moltitudine di interazioni cellula-cellula. Pertanto, è probabile che il comportamento delle colture cellulari isolate sia artificiale rispetto a quello osservato in un intero tessuto. Questo problema può essere in parte risolto utilizzando organoidi retinali differenziati in vitro, che possono essere utilizzati per studiare lo sviluppo e la biologia di base6. Tuttavia, ad oggi, la generazione organoide retinica richiede ancora molto tempo, richiede molto lavoro e soffre di problemi di riproducibilità, richiedendo un ulteriore lavoro di sviluppo sostanziale prima che gli organoidi possano essere utilizzati per la ricerca retinica traslizionale. Infine, gli studi sugli animali vivi, mentre probabilmente il modello più vicino alle esigenze della ricerca oftalmica, sono associati a forti preoccupazioni etiche. Un buon compromesso tra l'efficienza dei sistemi di coltura cellulare e la situazione reale dei modelli animali in vivo sono colture organotipiche di espianto retino. Tali colture riducono anche la sofferenza degli animali poiché non vengono eseguiti interventi in vivo.
Sono stati descritti diversi metodi per coltivare espianto retinale di diverse specie5,7,8. Il nostro protocollo descrive una tecnica per l'isolamento della neuroretina del topo insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE). Questa tecnica sarà adatta anche per colture retiniche di ratto9. La cultura della neuroretina insieme al suo RPE è di grande importanza per il successo. L'RPE svolge funzioni essenziali per la retina: trasporto di nutrienti, ioni, acqua, assorbimento della luce e protezione contro la fotoossidazione, reisomerazione dell'all-trans-retinica in 11-cis-retinica, che è fondamentale per il ciclo visivo, fagocitosi delle membrane fotorecettori a spargimento e secrezione di fattori essenziali per l'integrità strutturale della retina10. Il mantenimento dell'RPE consente uno sviluppo riuscito dei segmenti esterni ed interni del fotorecettore, mantenendo la retina vitale per un tempo più lungo11. La procedura descritta di seguito conserva le caratteristiche istotipiche e fisiologiche della retina per almeno due settimane12. Inoltre, coltivare le espianto retiniche organotipiche in mezzo privo di siero e privo di antibiotici evita la presenza di sostanze sconosciute e consente una semplice interpretazione dei risultati12.
Le colture organotipiche di espianto retino sono state essenziali per migliorare le nostre conoscenze sullo sviluppo retinale e sulla degenerazione7,13,14. Mostriamo qui che sono anche uno strumento utile per lo screening farmacologico e che possono essere utilizzati per modellare una varietà di malattie retiniche, compresa la retinopatia diabetica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+/-)-&#945;-LipoicAcid (=Thiotic acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDP-Choline-Na</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &#215; 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Tocopherol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanolamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur BT100, 1L, 0.2&#181;m</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3942.101</td>
			<td>for Basal Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps&#160;</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-CysteineHCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linolenic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 x 4H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaSeO3 x 5H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic microscope scaping spoon</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>10360-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>21935025</td>
			<td>44 mAnson U/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R16</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>07491252A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinyl acetate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filter 0.22&#181;m</td>
			<td>MILLEX GP</td>
			<td>SLGP033RS</td>
			<td>for supplements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tocopherylacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable supports</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin B12</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V6629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term, serum-free cultivation of organotypic mouse retina explants with intact retinal pigment epithelium

Nella ricerca oftalmica, c'è un forte bisogno di modelli in vitro della neuroretina. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per la 150% organotipico della neuro retina deltopo con epitelio pigmentato retinico intatto (RPE). A seconda della domanda di ricerca, le retine possono essere isolate da animali di tipo selvatico o da modelli di malattia, per studiare, ad esempio, la retinopatia diabetica o la degenerazione retinica ereditaria. Gli occhi dei primi giorni postnatali 2-9 animali vengono enucleati in condizioni asettiche. Sono parzialmente digeriti nella proteinasi K per consentire un distacco del coroide dall'RPE. Sotto lo stereoscopio, una piccola incisione viene fatta nella cornea creando due bordi da cui la coroide e la sclera possono essere delicatamente staccate dall'RPE e dalla neuroretina. L'obiettivo viene quindi rimosso e l'oculare viene tagliato in quattro punti per dargli una forma a quattro spicchi simile a una foglia di trifoglio. Il tessuto viene infine trasferito in una goccia appesa in un inserto di coltura cellulare che tiene una membrana di coltura in policarbonato. Le colture vengono poi mantenute in mezzo R16, senza siero o antibiotici, in condizioni completamente definite, con un cambio medio ogni secondo giorno.
La procedura descritta consente l'isolamento della retina e la conservazione del suo normale contesto fisiologico e istotipico per periodi di coltivazione di almeno 2 settimane. Queste caratteristiche rendono le colture organotipiche di espianto retino un modello eccellente ad alto valore predittivo, per studi sullo sviluppo retinale, sui meccanismi delle malattie e sull'elettrofisiologia, consentendo allo stesso tempo lo screening farmacologico.

Dopo aver seguito il protocollo, le espianto retiniche sezionate e coltivate preservano la loro normale architettura tissutale, con strati distinti, dall'RPE allo strato cellulare ganglio (GCL), come mostrato nella figura 2. Le dimensioni dello strato nucleare esterno (ONL) e dello strato nucleare interno (INL) rimasero per lo più stabili per 2-3 settimane, con una perdita cellulare che progredisce lentamente e un graduale assottigliamento di questi strati che diventava sempre più evidente se il periodo di culto è prolungato a 4 settimane e oltre. Nel GCL, al contrario, a causa dell'assotomia del nervo ottico, un marcato assottigliamento si osserva di solito entro i primi 4 giorni dalla ristrutturazione. Successivamente, la popolazione di cellule rimanenti nel GCL (cellule di amacrina per lo più spostate) continuerà ad essere vitale per altre 3-4 settimane17,18,19.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig02.jpg"> Figura 2: Tipi di cellule presenti nelle impostazioni cultura delle piante esplant retiniche. Coltura di espianto retinale in P11 derivata da animali mutanti rd1 (A) e WT (B) che mostrano colorazione nucleare con cellule DAPI (sinistra, blu), fotorecettori di aste (al centro, rosso) e celle Müller (destra, verde). La colorazione nucleare evidenzia tutti i principali strati cellulari della retina come l'epitelio pigmentato retinico (RPE), lo strato nucleare esterno (ONL), lo strato nucleare interno (INL) e lo strato di cellule gangliari (GCL). Tipi di cellule specifiche negli strati nucleari, come aste e cellule di Müller, sono immunoetichettati rispettivamente con anticorpi alfa arrestin26 e glutammina synthetasi27. (C) Mostra la sezione a lunghezza intera di   un'intera retina del mouse rd1, con colorazione DAPI che evidenzia la coerenza, l'integrazione e lo sviluppo della retina. Queste retine sono state coltivate per 6 giorni. Descrizione della procedura: Retina e RPE derivati da animali rd1 o WT sono stati isolati a P5 e coltivati come descritto nel protocollo, fino a P11 con un cambiamento medio ogni 48 h. Le colture sono state fissate con il 4% di PFA a P11 e criosezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig02large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura</a>
Il mezzo privo di siero e l'ambiente in vitro sostenuto consentono di avere il pieno controllo sulle condizioni sperimentali. Qui, forniamo due esempi per applicazioni specifiche di questo protocollo. Il primo esempio illustra la possibilità di utilizzare espianto retinale per test antidroga o screening. Le colture organotipiche di espianto retiniche sono state preparate con modelli di mouse di tipo selvaggio (WT) e rd1. Quest'ultimo è un modello ben caratterizzato per la degenerazione retinica15. Nella retina del mouse rd1, la degenerazione ONL è innescata da livelli anormalmente elevati di cGMP nei fotorecettoridell'asta 6,20. L'eccessivo cGMP causa una maggiore attività dei canali ionici gated nucleotidici ciclici (CNGC) e della protein chinasi cGMP-dipendente (PKG), portando alla morte cellulare21. Il trattamento delle retine del topo rd1 con un analogo strutturale a cGMP (nucleotide ciclico #3; CN003), che si rivolge sia al PKG che al CNGC, è stato testato. Dopo l'espianto in P5, è stato seguito il paradigma di trattamento descritto nella figura 3A. Le colture di espianto sono state fissate con il 4% di PFA a P11 e preparate per la criosezione(figura 3A). Per valutare la morte cellulare di sezioni istologiche da campioni trattati, non trattati (NT) e WT, è stato eseguito un saggio terminale di deossinucleotidil transferasi dUTP nick end labeling (TUNEL)22. L'analisi delle cellule etichettate TUNEL ha mostrato un'alta percentuale di cellule morenti nell'ONL dei campioni non trattati rd1, mentre i fotorecettori del topo rd1 protetti cn003 se applicati a una concentrazione di 50 μM23 (Figura 3B).
Una frequente complicanza del diabete è la retinopatia diabetica, una malattia accecante che è difficile da riprodurre fedelmente nei modelli animali5. Il secondo esempio evidenzia l'uso di colture organotipiche di espianto retiniche per caratterizzare la vitalità cellulare retinica in condizioni che emulano il diabete mellito di tipo 2 (T2DM)24. Qui, abbiamo usato 20 mM dell'inibitore della glicolisi 2-deossi-glucosio (2-DG)25 e lo abbiamo somministrato al mezzo di coltura per 24 ore da P10 a P11. Mostriamo che sottosopporsi di espianto retiniche WT a tali condizioni diabetiche simulate in vitro porta a un'estesa morte cellulare neuronale della retina ( Figura3C). Questo paradigma a sua volta può quindi essere utilizzato, ad esempio, per studiare meccanismi degenerativi o per testare trattamenti retinoprotettivi in un contesto di diabete.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61868/61868fig03.jpg"> Figura 3: Due esempi per applicazioni dicolture organotipiche di escrezione retinica. (A) Descrizione della procedura: Retina e RPE derivati da animali rd1 o WT sono stati isolati nel giorno postnatale (P) 5 e coltivati come descritto sopra, con un cambiamento medio ogni 48 ore. A P7 e P9, il mezzo speso è stato scartato e alla piastra è stato aggiunto cm fresco contenente composto attivo ad una concentrazione di 50 μM. Le colture sono state fissate con il 4% di PFA a P11 e criosezione. (B) Prove composte sulla retina rd1. Le sezioni sono state ottenute da colture di escrezione retinica organotipiche WT, trattate (003) e non trattate (NT). Il saggio TUNEL (rosso) è stato usato come marcatore per la morte cellulare. Colorazione nucleare con DAPI (blu). La quantificazione mostrata nel grafico a barre illustra le percentuali di cellule morenti in condizioni WT, rd1 NT e rd1 003. Il trattamento con composto 003 ha ridotto significativamente la morte cellulare del fotorecettore rd1. (C) Simulazione del diabete mellito di tipo 2 (T2DM) sulla retina WT mediante trattamento con 2-deossic glucosio (2-DG). Il test TUNEL è stato eseguito su campioni NT e T2DM. La quantificazione indica un aumento molto significativo della morte cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/61868fig03large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura</a>
Tabella S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S1%20-%20Basal%20Medium.doc" target="_blank">Clicca qui per scaricare la tabella</a>  
Tabella S2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S2%20-%20Supplements.doc" target="_blank">Clicca qui per scaricare la tabella</a>  
Tabella S3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61868/Table%20S3%20-%20Complete%20Medium.doc" target="_blank">Clicca qui per scaricare la tabella</a>

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Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

Il protocollo descrive le espianto organotipiche della neuroretina deltopo,coltivate insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE), in mezzo definito R16, privo di siero e antibiotici. Questo metodo è relativamente semplice da eseguire, meno costoso e dispendioso in termini di tempo rispetto agli esperimenti in vivo, e può essere adattato a numerose applicazioni sperimentali.

Coltivazione a lungo termine e priva di siero di estipe di retina di topo organotipico con epitelio pigmentato retinico intatto

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  University of Tübingen. Il protocollo descrive le espianto organotipiche della neuroretina deltopo,coltivate insieme al suo epitelio pigmentato retinico (RPE), in mezzo definito R16, privo di siero e antibiotici. Questo metodo è relativamente semplice da eseguire, meno costoso e dispendioso in termini di tempo rispetto agli esperimenti in vivo, e può essere adattato a numerose applicazioni sperimentali.

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Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Ricerca

Neuroscienze

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human retina and is therefore a valuable species for studying mechanisms of human retinal injury and degenerative disease. Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina isolated from eyes obtained from an abattoir. After removing the anterior segment, a trephine blade was used to create multiple neural retina-Bruch's membrane-RPE-choroid-sclera explants from the posterior segment of adult porcine eyes. A piece of sterile filter paper was used to lift the neural retina off from each explant. The filter paper-retina complex was cultured (photoreceptor side up) atop an insert, which was held away from the bottom of the culture dish by a custom-made stand. The stand allows for good circulation of the culture medium to both sides of the retina. Overall, this procedure is simple, reproducible, and permits preservation of native retinal structure for at least seven days, making it a useful model for a variety of morphological, pharmacological, and biochemical studies on mammalian retina.

Here we describe a cost-effective technique for organotypic culture of adult porcine retina for seven days. Briefly, a sterile filter paper was used to lift the neural retina off from the RPE and place photoreceptor side up on an insert raised by a custom-made stand.

Cultura organotipica di tutto spessore Retina suina adulti

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbare Approccio-sottoretinico iniezione di vettori virali per la terapia genica nei topi retina epitelio pigmentato

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

A lungo termine conflitto sensoriale a comportarsi liberamente topi

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent protein kinase (PKG) pathway in photoreceptor cells causes photoreceptor cell death, especially in models harboring phosphodiesterase 6b (PDE6b) mutations. Previous studies on RD have used mainly murine models such as rd1 or rd10 mice. Given the genetic and physiological differences between mice and humans, it is important to understand to which extent the retinas of primates and rodents are comparable. Macaques share a high level of genetic similarity with humans. Therefore, wild-type macaques (aged 1-3 years) were selected for the in vitro culture of retinal explants that included the retina-retinal pigment epithelium (RPE)-choroid complex. These explants were treated with different concentrations of the PDE6 inhibitor zaprinast to induce the cGMP-PKG signaling pathway and simulate RD pathogenesis. cGMP accumulation and cell death in primate retinal explants were subsequently verified using immunofluorescence and the TUNEL assay. The primate retinal model established in this study may serve for relevant and effective studies into the mechanisms of cGMP-PKG-dependent RD, as well as for the development of future treatment approaches.

Retinal explants obtained from wild-type macaques were cultured in vitro. Retinal degeneration and the cGMP-PKG signaling pathway was induced using the PDE6 inhibitor zaprinast. cGMP accumulation in the explants at different zaprinast concentrations was verified using immunofluorescence.

Colture organotipiche di espianti retinici da scimmia macaco

Hereditary retinal degeneration (RD) is characterized by progressive photoreceptor cell death. Overactivation of the cyclic guanosine monophosphate ...

Studio delle cellule neuronali bipolari e orizzontali nella retina divisa murina

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

Autore in primo piano: Utilizzo della tecnica Split Retina per un accesso migliorato e esperimenti accelerati 

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.