La trasduzione del segnale è uno degli argomenti più importanti nella ricerca biologica e farmaceutica. Richiede proteine di membrana per trasmettere segnali alla loro proteina partner di segnalazione intracellulare. Questo protocollo è progettato per eseguire uno screening sistematico del detergente in preparazione di un complesso di segnalazione che mira alla determinazione della struttura.
Questo protocollo utilizza tecniche comunemente disponibili in un laboratorio di biologia ben consolidato ed essere facilmente eseguito dai principianti sul campo. Abbiamo composto questi metodi per trovare il parametro più critico nella preparazione del complesso proteico di membrana. Per iniziare, scongelare 30 grammi di pellet di cellule I-carenti di HEK293 GNT a temperatura ambiente e trasferirlo in un becher.
Aggiungere 120 millilitri di tampone PBS contenenti cocktail inibitore della proteasi e omogeneo utilizzando un omogeneizzatore Dounce o un omogeneizzatore elettrico a 13.000 giri/min per 30 secondi. Regolare il volume a 150 millilitri con buffer PBS. Aggiungere delicatamente il 10%DDM alle cellule omogeneizzate per dare una concentrazione finale dell'1,25% Mescolare sul ghiaccio per un'ora.
Dopo la solubilizzazione, centrifugare il lysate cellulare a quattro gradi Celsius e 150,000 volte G per 45 minuti per rimuovere i detriti nonsolubilizzati. Trasferire il supernatante in una bottiglia da 500 millilitri e aggiungere 10 millilitri della resina di agarosio ad immuno-affinità 50%1D4. Mescolare delicatamente il llysato cellulare solubilizzato e la resina per quattro ore o durante la notte a quattro gradi Celsius per consentire il legame proteico.
Caricare la miscela di resina lisato su una colonna aperta per raccogliere la resina. Lavare la resina con 10 volumi di colonna di tampone di lavaggio A per rimuovere il contaminante proteico. Chiudere la valvola e rimospendare la resina con due volumi di colonna di tampone A.Next, in condizioni di luce rossa fioca, aggiungere 9-cis Retinal alla resina rimossata ad una concentrazione finale di 50 micromolare.
Mescolare delicatamente a quattro gradi Celsius per quattro-16 ore al buio per la legatura retinica. Successivamente, aprire il valore e rimuovere il buffer dalla colonna. Lavare la resina con 20 volumi di colonna di tampone A, seguita da 15 volumi di colonna del tampone B per rimuovere la retina non vincolata.
Resuspend la resina in due volumi di colonna di tampone B e quindi dividere equamente la sospensione in resina a 10 colonne di smaltimento da 10 millilitri. Rimuovere il tampone dalle 10 colonne e quindi rimospendare la resina ciascuno in un millilitro di tampone C per il cambio del detergente. Incubare per un'ora sul ghiaccio.
Ripetere ancora una volta il lavaggio e l'incubazione nel tampone C. Rimuovere il tampone dalle colonne e quindi rimospendare la resina in 0,8 millilitri di tampone di eluizione per ogni colonna. Mescolare delicatamente per due ore.
Raccogliere l'eluizione da ogni colonna in un tubo. Resuspend la resina in 0,7 millilitri di tampone di eluizione per ogni colonna. Mescolare delicatamente per un'ora.
Raccogliere l'eluizione da ogni colonna negli stessi tubi. Al buio, caricare la proteina elusa nella cuvetta al quarzo. Misurare lo spettro del campione proteico.
Illuminare la proteina direttamente nella cuvetta per due minuti con il passaggio della luce del filtro passa lungo 495 nanometri. Misurare lo spettro del campione illuminato. Eseguire la stessa misurazione per tutti i campioni proteici purificati negli altri nove detergenti.
Stati sia scuri che illuminati. Alla luce normale, per ogni condizione detergente preparare 100 microlitri di rodopsina a 0,7 milligrammi per millilitro. A luci rosse fioche, preparare 100 microlitri di miscela di rodopsina a 0,7 milligrammi per millilitro e mini-GO a 0,2 milligrammi per millilitro.
Integrare la miscela con un cloruro di magnesio millimolare. Illuminare la miscela con la luce da un filtro passa lungo 495 nanometri e incubare per 30 minuti. Trasferire i campioni sulle fiale del campionatore automatico e posizionarli nel vassoio del campione.
Programmare un file di metodo per automatizzare le esecuzioni SEC sequenziali per ogni campione con il campionatore automatico che carica 77 microlitri del campione nella colonna e il purificatore che elude 25 millilitri di buffer SEC per esecuzione. Registrare l'assorbanza a 280 nanometri e 380 nanometri. Raccogliere le frazioni di picco del complesso rodopsina e rodopsina-mini-GO al volume di ritenzione intorno a 12,9 millilitri.
Analizzare i campioni di rodopsina sinistra e le frazioni di picco del complesso rodopsina-mini-GO su gel gradienti denaturanti da quattro a 12%SDS con colorazione blu Coomassie. Preparare una miscela di 200 microlitri di rodopsina a un milligrammo per millilitro e PNGase F a 0,01 milligrammi per millilitro. Mescolare bene e incubare sul ghiaccio durante la notte.
Preparare una miscela di 200 microlitri di rodopsina a un milligrammo per millilitro e Endo F1-13 a 0,01 milligrammi per millilitro. Mescolare bene e incubare sul ghiaccio durante la notte. Analizzare il risultato della digestione mediante colorazione blu SDS-Page e Coomassie.
In questo studio, la configurazione di purificazione su piccola scala ha prodotto proteine sufficienti per ulteriori analisi. Gli spettri visibili ultravioletti della rodopsina mostrano lo stato scuro 9-cis rodopsina legata alla retina nelle curve blu. Dopo l'illuminazione, la retina 9-cis viene deproteinata e isomerizza in tutta la trans-retinica.
I rapporti degli assorbenti a 280 nanometri su assorbenti 488 nanometri e assorbenti a 280 nanometri sopra assorbenti a 380 nanometri rappresentano la stabilità della rodopsina purificata in ogni detergente. Qui sono riportati i profili cromatografici di esclusione delle dimensioni del complesso rodopsina e rodopsina-mini-GO purificati in 10 detergenti diversi. Il profilo delle proteine marcatori standard è mostrato come sovrapposizione insieme al campione DDM.
L'interpretazione dei profili di picco è mostrata per DMNG con lo scenario ideale visto per DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 e OGNG. Il profilo ingrandito del campione OGNG mostra che sia il complesso rodopsina che il complesso rodopsina-mini-GO sono sfuggiti intorno allo stesso volume di ritenzione. L'analisi SDS-Page dei campioni purificati di rodopsina e SEC del complesso rodopsina-mini-GO è mostrata qui.
Questa figura mostra l'analisi SDS-Page della deglicosilazione della rodopsina con enzimi Endo F1 e PNGase F. È fondamentale eseguire lo screening dei detergenti in modo sistematico, in modo che l'impatto di ogni singolo detergente possa essere chiaramente confrontato senza ambiguità. Per proteine di varie quantità, il saggio di spostamento termico può anche essere utilizzato per studiare l'impatto del detergente sulla stabilità proteica.
Grazie a questo metodo, siamo in grado di preparare un complesso proteico stabile ed eventualmente risolvere la struttura cristallina persa nel geo-assemblaggio. Ha fornito importanti informazioni sulla specificità dell'interazione proteica GPCR-G.
