Questo studio presenta un protocollo per la differenziazione delle cellule precursori neurali indotte esclusivamente dalla stimolazione dell'impulso a corrente continua in un sistema microfluidico. Questa tecnica fornisce un approccio utile per ridurre il tempo di configurazione sperimentale, il volume del campione e il volume del reagente. Inoltre, il chip MOE è adatto per osservazioni di microscopia confocale.
Il semplice trattamento dell'impulso a corrente diretta può controllare il destino delle cellule precursori neurali del topo e potrebbe essere utilizzato per sviluppare strategie terapeutiche per i disturbi del sistema nervoso. Per iniziare, disegna modelli per i singoli livelli PMMA e il nastro a doppia aspetto utilizzando un software appropriato. Accendere lo scriber laser ad anidride carbonica e collegarlo a un personal computer.
Aprire il file del modello progettato utilizzando il software. Posizionare i fogli PMMA o il nastro a doppia mano sulla piattaforma dello scriber laser, quindi mettere a fuoco il laser sulla superficie dei fogli PMMA o sul nastro a doppia mano utilizzando lo strumento di messa a fuoco automatica. Selezionare lo scriber laser come stampante, quindi utilizzare lo scriber laser per avviare l'ablazione diretta sul foglio PMMA o sul nastro a doppia mano.
Rimuovere il film protettivo dai fogli PMMA e pulire la superficie utilizzando gas azoto. Per legare insieme più strati di fogli PMMA, impilare tre pezzi di fogli PMMA di un millimetro e incollarli sotto una pressione di cinque chilogrammi per centimetro quadrato in un bonder termico per 30 minuti a 110 gradi Celsius per formare il flusso o l'assemblaggio del canale di stimolazione elettrica. Aderire a 12 pezzi di adattatori alle singole aperture nello strato uno dei chip assemblaggio MOE con colla cianoacrilato ad azione rapida.
Disinfettare i substrati PMMA di un millimetro, il nastro a doppia fronte e il PMMA di grado ottico di tre millimetri utilizzando l'irradiazione ultravioletta per 30 minuti prima di assemblare il chip. Aderire ai substrati PMMA di un millimetro sul PMMA di grado ottico di tre millimetri con il nastro a doppia parte per completare l'assemblaggio PMMA. Aderire al coperchio pulito all'assieme PMMA con il nastro a doppia mano.
Sigillare le aperture degli adattatori a ponte agar con spine bianche a tenuta di dita. Collegare il connettore inferiore piatto all'assieme del chip MOE tramite gli adattatori di ingresso e di uscita medi, quindi collegare l'adattatore Luer a cono ai fermanti a tre vie. Aggiungere due millilitri di soluzione 0,01%PLL utilizzando una siringa da tre millilitri che si collega al fermallo a tre strade dell'ingresso medio e collegare una siringa vuota da tre millilitri al fermallo a tre strade della presa media.
Riempire le regioni di coltura cellulare con la soluzione PLL e pompare lentamente la soluzione di rivestimento avanti e indietro. Chiudi i due fermalusi a tre per sigillare la soluzione all'interno delle regioni culturali. Incubare il chip MOE a 37 gradi Celsius durante la notte in un incubatore pieno di atmosfera di anidride carbonica al 5%.
Aprire i due fermanti a tre e sciacquare le bolle nei canali pompando manualmente la soluzione di rivestimento avanti e indietro nel canale utilizzando le due siringhe. Disegnare tre millilitri di mezzo completo in una siringa da tre millilitri che si collega al fermaporto a tre via dell'ingresso medio e aggiungerlo per sostituire la soluzione di rivestimento nelle regioni di coltura cellulare. Sostituire la spina bianca a tenuta di dita con l'adattatore Luer e iniettare agarosio caldo al 3% per riempire l'adattatore.
Collegare la siringa di blocco Luer all'adattatore Luer e iniettare agarosio caldo al 3% attraverso il bong di gomma nera per riempire la siringa di blocco Luer. Lasciare raffreddare e solidificare da 10 a 20 minuti per l'agarosio. Installare il chip MOE seminato a celle sul riscaldatore ITO trasparente fissato su uno stadio motorizzato XYZ programmabile mantenuto a 37 gradi Celsius.
Infondere gli mNPC pompando manualmente nel chip MOE attraverso la presa media, quindi incubare il chip MOE seminato a cellule sul riscaldatore ITO per quattro ore. Utilizzare fili elettrici per collegare un multiplexer EF al chip MOE tramite gli elettrodi sul chip. Collegare un multiplexer EF e un generatore di funzioni a un amplificatore per emettere impulsi CC ad onda quadra.
Rimuovere tutti i connettori e gli adattatori inferiori piatti sul chip MOE e riempire gli adattatori con PBS, quindi sigillare le aperture dell'adattatore con parafilm. Dopo l'immunosocienza, osservare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale. La stimolazione dell'impulso DC ha portato a mNPC simultanei che si differenziano in neuroni, astrociti e oligodendrociti nel mezzo di mantenimento delle cellule staminali.
Le percentuali di neuroni, astrociti e oligodendrociti nel gruppo di controllo e nel gruppo di stimolazione sono mostrate qui. Dopo il trattamento dell'impulso DC, gli mNPC hanno espresso un numero significativamente elevato di neuroni a DIV sette, astrociti a DIV tre e oligodendrociti a DIV sette e DIV 14 erano presenti a livelli relativamente più alti nei gruppi di stimolazione che nel gruppo di controllo. Le neurosfere formate da 30 a 40 cellule sono preferite per iniziare la differenziazione mNPC.
La crescita troppo degli MNPC comprometterà la sopravvivenza cellulare durante il processo di differenziazione.
