I dispositivi microfluidici compartimentati consentono ai neuroni di essere studiati nella loro forma altamente polarizzata. Questi dispositivi sono fondamentali sia per la ricerca di base che per la ricerca trascizionale delle neuroscienze. Questo protocollo descrive come utilizzare chip ciclici di copolimero olefine per compartimentare i neuroni differenziati dalle cellule staminali umane.
Questi chip COC producono colture più sane di neuroni differenziati su dispositivi multicomparto PDMS. In questo protocollo, dimostriamo la coltura di neuroni differenziati dalla linea di cellule staminali H9 approvata dal NIH. Procedure simili possono essere utilizzate per differenziare i neuroni dai mIC.
I trucioli multicomparto devono essere collocati in contenimento secondario con ulteriore umidificazione. I canali dei trucioli multicomparto devono essere riempiti con una soluzione di precoat e quindi lacche di PBS. Per iniziare, sciogliere la poli-L-ornitina in acqua distillata di grado di coltura cellulare per creare 600 microlitri di soluzione per chip.
Aspirare il PBS rimanente dai pozzi, assicurandosi che la punta della pipetta sia lontana dall'apertura del canale. Caricare bene 150 microlitri di poli-L-ornitina in alto a destra. Attendere 90 secondi e aggiungere bene 150 microlitri della soluzione in basso a destra.
Attendere cinque minuti e ripetere il processo di caricamento con la soluzione per i pozzali sinistro. Quindi, posizionare il vassoio dell'umidificatore con il truciolo a quattro gradi Celsius durante la notte. Se si utilizza una piastra di Petri, avvolgerla con Parafilm e posizionarla a quattro gradi Celsius durante la notte.
Successivamente, aspirare la soluzione dai pozzi, assicurando che la punta della pipetta sia posizionata lontano dall'apertura del canale. E ripetere il caricamento dei pozzi destro e sinistro con 150 microlitri ciascuno di acqua sterile due volte. Preparare la soluzione di lavoro laminina.
Caricare i pozzi destro e sinistro con 150 microlitri ciascuna della soluzione di lavoro laminina. Incubare il truciolo all'interno del vassoio per due ore a 37 gradi Celsius. Risciacquare il truciolo con PBS senza calcio e magnesio.
Caricare i pozzi destro e sinistro con 150 microlitri ciascuno di PBS. Aspetta cinque minuti. Aspirare il PBS dai pozzi e sciacquare il chip con i supporti NSC.
Caricare i pozzi destro e sinistro con 150 microlitri ciascuno dei supporti NSC. Incubare il chip nel vassoio durante la notte nell'incubatore di 37 gradi Celsius con 5%CO2 per pre-condizionare il chip. Per seminare le cellule staminali neurali umane nel chip multicomparto, conta prima la concentrazione cellulare usando un emocitometro.
Quindi, aspira i media dai pozzi. Pipettare cinque microlitri della soluzione cellulare in alto a destra bene, seguiti da cinque microlitri in basso a destra bene. Utilizzare un microscopio per verificare che le celle siano entrate nel canale.
Attendere cinque minuti affinché le cellule aderiscano alla parte inferiore del chip. Pipetta circa 150 microlitri di supporti NSC ai pozzi destro e sinistro. Incubare a 5%CO2, 37 gradi Celsius all'interno di un contenitore umidificato adatto.
Dopo 48 ore, aspira i supporti NSC dai pozzi e sostituiscilo con mezzi di differenziazione neurale aggiungendo 150 microlitri a ciascun pozzo superiore e a ciascun pozzo inferiore. Neuroni della coltura all'interno di un incubatore 5%CO2, 37 gradi Celsius all'interno di un vassoio umidificatore. Rimuovere i restanti mezzi di differenziazione neurale dal compartimento assonale e posizionarlo in un tubo di centrifuga.
Conservare a 37 gradi Celsius. Mescolare 50 microlitri della soluzione virale con 150 microlitri dei mezzi riscaldati. Pipetta 100 microlitri della miscela a entrambi i pozzi del compartimento dell'assone.
Incubare per due ore all'interno di un incubatore di 37 gradi Celsius. Prelevare e smaltire i supporti contenenti virus. Pipettare delicatamente 75 microlitri del supporto fresco su un compartimento assone e lasciare che il supporto fluisa attraverso il canale in un altro assone bene.
Ripetere questo processo una volta. Infine, riempire il compartimento dell'assone con il supporto salvato e trasferire il chip nell'incubatore. Dopo una settimana nel chip con i mezzi di differenziazione, le cellule staminali neurali umane si differenziano in neuroni, attaccate e distribuite uniformemente all'interno del compartimento somatico.
In confronto, i neuroni nei dispositivi PDMS si sono aggregati già cinque giorni dopo l'aggiunta di mezzi di differenziazione, portando a una salute cellulare compromessa. La visualizzazione di neuroni etichettati e spine dendritiche con proteina fluorescente mCherry ha mostrato che i neuroni derivati dall'NSC differenziati all'interno dei chip formano sinapsi mature. I neuroni sono stati etichettati per il marcatore sinaptico eccitatorio, vGlut1.
I risultati dell'immunostaining mostrano che i neuroni etichettati viralmente potrebbero co-localizzare con vGlut1, e il marcatore specifico dei neuroni, Beta-tubulina tre. I neuroni mCherry trasdotti viralmente estendono le proiezioni in un microambiente localizzato sull'assone stabilito all'interno del chip preassemblato. Un confronto tra le immagini dei neuroni etichettati mCherry prima e subito dopo l'assotomia ha mostrato assoni completamente mozzati.
È fondamentale assicurarsi che i canali rimangano pieni di fluido tranne quando si esegue la procedura di assotomia. I chip compartimentati in COC sono facili da usare e possono aprire le porte a numerose indagini relative a lesioni neuronali, sinaptogenesi, plasticità sinaptica e fisiopatologia della malattia.
