M.Z. e K.S.F. e questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione assegnata nell'ambito del Pitt Innovation Challenge (PInCh), attraverso il Clinical and Translational Science Institute dell'Università di Pittsburgh, e la borsa NHLBI R01 HL153407, assegnata a M.Z.

Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh ha approvato tutti i protocolli sugli animali specificati nella presente pubblicazione prima di intraprendere uno di questi esperimenti sugli animali.
NOTA: Questo protocollo descrive in dettaglio come eseguire studi di clearance mucociliari in vivo utilizzando l'imaging di radionuclidi con uno scanner SPECT/CT a doppia modalità. Le tecniche dimostrate sono l'esecuzione di calibrazioni del sistema, l'anestesia dei topi, l'intubazione tracheale dei topi, l'instillamento dell'isotopo nei polmoni, l'imaging a doppia modalità, la co-registrazione di queste immagini e l'analisi.
1. Configurazione del sistema SPECT/CT
<ol><li>Progettare un flusso di lavoro appropriato e configurare prima di eseguire esperimenti utilizzando animali viventi.<ol>
<li>Utilizzare un'acquisizione SPECT composta da 60 proiezioni con una dimensione del passo di 6o tra le proiezioni con un raggio di rotazione di 40 cm. L'acquisizione di CT è costituita da 220 proiezioni con un angolo di 1,6o tra le proiezioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Assicurarsi che il sistema abbia in atto i collimatori MWB corretti per i topi e l'imaging SPECT. Se vengono installati collimatori inappropriati, utilizzare la procedura guidata collimatore per installare quelli corretti.</li>
	<li>Eseguire le calibrazioni di sistema necessarie per preparare il sistema per l'uso. NOTA: I componenti SPECT e CT dello scanner necessitano di calibrazione. Calibrare i componenti CT utilizzando un condizionamento della sorgente e una calibrazione Dark/Light (D/L) una volta al giorno, una calibrazione Center Offset (COS) ogni 2 settimane e valutare l'hardware a raggi-X ogni mese. I componenti SPECT devono essere calibrati una volta all'anno.<ol>
<li>Per valutare l'hardware a raggi-X, selezionare la casella Valuta hardware a raggi X durante le calibrazioni CT(Menu di calibrazione CT supplementare).</li>
		<li>Per eseguire il condizionamento della sorgente, selezionare la casella Esegui condizionamento sorgente durante le calibrazioni CT(Menu di calibrazione CT supplementare).</li>
		<li>Per eseguire una calibrazione D/L, selezionare la casella D/L accanto al protocollo di acquisizione CT utilizzato durante gli esperimenti durante le calibrazioni CT. Deselezionare tutti gli altri protocolli(Menu di calibrazione CT supplementare).</li>
		<li>Per eseguire una calibrazione COS, sostituire il letto con lo strumento anello di calibrazione, regolare le impostazioni del tipo di letto in modo che corrispondano alle impostazioni di controllo del movimento e selezionare la casella COS accanto al protocollo di acquisizione CT utilizzato durante gli esperimenti durante le calibrazioni CT. Deselezionare tutti gli altri protocolli(menu di calibrazione CT supplementare, anello di calibrazione supplementare).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Intubazione e instillazione del topo
<ol><li>Pesare i topi da scansionare. Se si scansionano più topi, fare attenzione a contrassegnare i topi a scopo di identificazione utilizzando metodi come la punzonatura dell'orecchio o la marcatura della coda.</li>
	<li>Anestetizzare un topo usando l'1,5% di isoflurane con un flusso di gas di 2 L/min O2 in una camera a gas per ~5 minuti per produrre anestesia di profondità sufficiente, fino a quando la respirazione rallenta a ~ 55-65 respiri al minuto 16 (Figura 1A).</li>
	<li>Rimuovere il mouse dalla camera e sospendere con gli incisivi anteriori su un supporto di intubazione a 45o pendenza. Dotare il supporto di intubazione di un cono del naso per assicurarsi che il mouse sia anestetizzato durante l'intubazione (Figura 1B).</li>
	<li>Collegare un'estremità di un filo in fibra ottica da 50 μm a una sorgente luminosa e infilare una cannula calibro 20 su di essa utilizzando il filo per fungere da guida (Figura 1C).</li>
	<li>Aprire la bocca del mouse e tirare la lingua in avanti usando forcep smussate. Illuminare il filo guida e utilizzarlo per visualizzare le corde vocali (Figura 1D).</li>
	<li>Passare il filo guida attraverso le corde vocali in modo che il filo sia appena oltre le corde vocali e riposare nella trachea superiore. Far scorrere la cannula da 1 pollice in avanti lungo il filo per intubare il mouse, passando la cannula abbastanza in profondità in modo che il suo fulcro sia contro gli incisivi dell'animale (Figura 1E). Rimuovere il filo lasciando la cannula in posizione.</li>
	<li>Testare l'intubazione collegando brevemente la cannula con un dito e controllando i cambiamenti nella respirazione. La respirazione interrotta o la respirazione tesa durante la tappatura e la respirazione accelerata al momento del rilascio sono segni di corretta intubazione tracheale. Se non vi è alcun cambiamento nei modelli respiratori al momento dell' tappatura della cannula, quest'ultima è probabile nell'esofago.</li>
	<li>Preparare 0,2 mCi di colloide tecnezio-zolfo da 99m(99mTc-Sc) in un volume di 10 μL e pipetta nella cannula. Lasciare che il topo lo inali spontaneamente nei polmoni per oltre 1-2 min(Figura 1F). Rimuovere la cannula prima di trasferire il mouse sul pallet dello scanner. NOTA: Il radionuclide è stato preparato e filtrato da Cardinal Health.</li>
</ol>3. Imaging SPECT/CT
<ol><li>Trasferire il mouse su un pallet da 25 mm con un cono del naso e fissare con nastro adesivo, facendo attenzione a non rastremare troppo strettamente il torace e l'addome per evitare di compromettere la respirazione. Fare attenzione a rimuovere eventuali auricolari metallici attaccati al mouse.</li>
	<li>Preparare un fantasma radioattivo costituito da 0,05 mCi in 200 μL e posizionare questa quantità in un tubo PCR da 0,2 ml. Posizionare il tubo toccando il pallet sotto l'addome inferiore del mouse, evitando sovrapposizioni con i polmoni. NOTA: Il fantasma viene utilizzato allo scopo di co-registrare le immagini CT e SPECT, nonché un controllo negativo per la clearance.</li>
	<li>Inserire il mouse nel sistema SPECT/CT, selezionare il flusso di lavoro di imaging ed eseguire setup.</li>
	<li>Impostare il posizionamento dei rilevatori sul mouse ed eseguire il flusso di lavoro di imaging.</li>
	<li>Preparare una gabbia per topi che hanno ricevuto la post-procedura di radioattività, con accesso illimitato a cibo e acqua e etichettatura chiara utilizzando un adesivo di sicurezza per le radiazioni.</li>
	<li>Al termine del flusso di lavoro, rimuovere il mouse dal pallet di imaging e consentirgli di recuperare nella gabbia preparata per una durata di 6 ore tra le scansioni (fine scansione 1 fino all'inizio della scansione 2) con accesso ad libitum a cibo e acqua. 6 h è stato scelto in quanto corrisponde al periodo di tempo in cui il gioco lineare a seconda della funzione ciglia sta avvienendo con pochissima distanza alveolare.</li>
	<li>Dopo 6 ore, riaestestizzare il mouse e scansionare, insieme al fantasma, utilizzando lo stesso flusso di lavoro per misurare la quantità di isotopo cancellata dalle vie aeree. NOTA: È fondamentale consentire al mouse di riprendersi poiché l'anestesia ininterrotta con isoflurana per 6 ore porterà a un significativo effetto depressivo delle ciglia, con conseguente zero clearance mucociliari.</li>
</ol>4. Analisi
<ol><li>Dopo l'imaging, esegui la post-elaborazione per ricostruire le immagini complete dello stack 3D.<ol>
<li>Istogramma le immagini SPECT utilizzando le impostazioni standard di fabbrica per 99mTc, quindi ricostruire utilizzando un algoritmo MAP3D e la ricostruzione della funzione di diffusione del punto (PSF). NOTA: la ricostruzione è stata eseguita utilizzando 8 iterazioni e 6 sottoinsiemi. Una ricostruzione efficace richiede un rapporto tra sottoinsiemi e proiezioni a 1:10 o dividersi uniformemente nel numero di proiezioni, quindi 6 sottoinsiemi sono stati utilizzati a causa dell'acquisizione utilizzando 60 proiezioni.</li>
		<li>Ricostruire le immagini CT utilizzando l'algoritmo Feldkamp e un filtro Shepp-Logan. NOTA: La ricostruzione è stata eseguita utilizzando 4 iterazioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elaborare le immagini CT e SPECT in FIJI ImageJ21 utilizzando lo strumento reslice per generare immagini di visualizzazione coronale dalle immagini assiali predefinite. Quindi eseguire una proiezione di somma z-stack sull'immagine SPECT per aggiungere i dati di conteggio da ogni sezione e generare una singola immagine per facilitare l'analisi.</li>
	<li>Ridimensionare e co-registrare le immagini CT e SPECT utilizzando il tubo Eppendorf fantasma come riferimento (Figura 2A,B). Tenere traccia e utilizzare misurazioni di ridimensionamento coerenti in tutti gli esempi.</li>
	<li>Binarizzare l'immagine CT utilizzando la soglia automatica, seguita dall'inversione dello stack e dall'esecuzione di una proiezione di somma z-stack per generare un contorno dei polmoni per l'analisi (Figura 2C).</li>
	<li>Ruotare le immagini CT e SPECT e unire l'immagine utilizzando gli strumenti del canale. Calcolare MCC disegnando un ROI attorno al polmone destro e misurando (Figura 2D). NOTA: Questa misurazione sarà del conteggio totale nel polmone destro per i punti di tempo di 0 e 6 ore, con le immagini di 6 ore corrette per il decadimento radioattivo usando la formula: N(t) = N0e−t. 99m Tc-Sc ha una costante di decadimento di 3,21e−5 al secondo con un'emidità di ~6 ore. Questi valori possono quindi essere utilizzati per calcolare una percentuale di gioco. NOTA: Il polmone destro viene scelto per il prelievo e la misurazione del ROI poiché l'autorizzazione mucociliaria trasporterà il radioisotopo dai polmoni alla faringe da dove verrà inghiottito e finirà nello stomaco. Abbastanza spesso, i conteggi possono essere visti nello stomaco che possono sovrapporsi al polmone sinistro e quindi produrre conteggi erronei. Questa confusione può essere evitata misurando i conteggi solo nel polmone destro.</li>
</ol>

<ol>
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Il ruolo delle ciglia respiratorie motili sia nella malattia che nello sviluppo continua ad evolversi ed essere meglio apprezzato. Il battito sincrono e metacronale di ciglia multiple motile sulla superficie apicale delle cellule che rivestono l'albero tracheobronchiale genera un flusso di cefalodi che produce spazio mucociliario o MCC. MCC è compromessa in ciliopatie come PCD22, malattie acquisite come COPD18, e la sua importanza viene riconosciuta nei CHD, non tradizionalmente considerati ciliopatie. Dati recenti hanno mostrato disfunzione ciliaria respiratoria sia in CHD con eterotaxy23 che senza eterotassia7. Tale disfunzione della ciglia mobile ha dimostrato di tradursi in sintomirespiratori maggiori 9 e in una maggiore morbilità post-operatoria8. La maggior parte, se non tutte, di queste malattie, hanno modelli di topi disponibili e il nostro protocollo per misurare MCC nei topi è uno strumento prezioso che può essere utilizzato per testare potenziali terapie.
I modelli animali forniscono utilità per la comprensione delle malattie e lo sviluppo di terapie. L'imaging animale in vivo fornisce ulteriore utilità con la capacità di acquisire più punti dati dagli stessi animali, senza la necessità di sacrificare gli animali, consentendo agli investigatori di seguire il decorso longitudinale della malattia e di studiare la durata degli effetti del trattamento. Il modello di topo di MCC è stato sviluppato nel corso di decenni da più investigatori, inizialmente eseguito su cani beagle utilizzando la scintigrafia planare, una tecnica di imaging nucleare bidimensionale24. La tecnica è stata adattata per l'uso nei topi un decennio dopo, seguita dall'adattamento all'imaging SPECTun decennio dopo quel 25,26. Lo sviluppo di questa tecnica nei modelli di topo è stato uno sviluppo importante nella pertinenza di questa tecnica, a causa della disponibilità di più modelli di topi di malattie umane come la PCD in cui la funzione ciliaria è significativamente alterata. McC è stato valutato in modelli di topo di denervazione polmonare e immunosoppressione, e ha il potenziale per essere utilizzato in combinazione con altrimodelli 19,26. Sono stati condotti studi di misurazione MCC su pazienti umani con malattie delle vie aeree come CF, asma, PCD e ciliopatie associate alla CHD e hanno dato risultati che la tecnica può aiutare sia gli studi di fisiologia polmonare che l'efficaciaterapeutica 13.
Una parte importante di questo protocollo è l'impostazione di acquisizioni con i parametri di imaging corretti per acquisire immagini accurate per la quantificazione. Una serie di fattori sono fondamentali quando si progettano le impostazioni di acquisizione SPECT, tra cui quali collimatori vengono utilizzati, il numero di proiezioni da acquisire per rivoluzione e la dimensione del passo di rotazione. La selezione del collimatore è un fattore importante nella sensibilità e nella risoluzione dell'acquisizione e potrebbe essere necessario adattare le impostazioni di acquisizione al collimatoreutilizzato 27. In alternativa, quando si utilizzano animali più grandi come i ratti, i collimatori dovrebbero essere regolati. I collimatori a foro stenopeica multipli, ad esempio, sono più sensibili, ma è necessario prestare attenzione quando si seleziona una dimensione del passo al fine di evitare proiezioni sovrapposte e causare multiplexing indesiderato, che può aumentare ulteriormente la sensibilità dell'acquisizione a scapito di alcune ambiguità dell'immagine che possono causare artefatti diricostruzione 25. La configurazione della ricostruzione è anche la chiave per generare immagini quantificabili. MAP3D è un algoritmo di ricostruzione iterativa comunemente usato, e PSF è un modello di ricostruzione comune. Entrambi sono affidabili per la ricostruzione delle immagini, ma è necessario prestare attenzione quando si imposta il numero di iterazioni e sottoinsiemi. Un numero maggiore di iterazioni aumenterà il tempo computazionale necessario per la ricostruzione e aumenterà la qualità della ricostruzione con rendimenti decrescenti con un ulteriore aumento.
Per quantificare le immagini in ImageJ, lo strumento di misurazione ideale da utilizzare è RawIntDen, che restituisce il valore di somma dei pixel in una selezione. Quando si quantificano i dati SPECT tra ROI polmonari di dimensioni diverse, l'uso di RawIntDen fornisce una misura assoluta dei conteggi ed evita di regolare la misurazione nell'area del ROI, come farebbe la misurazione media21.
Questa tecnica ha una serie di fonti di errore associate di cui lo sperimentatore dovrebbe essere consapevole quando applica questa tecnica. Un importante confondatore è l'uso di agenti anestetici. L'isoflurane è un anestetico ad azione rapida e inalato da cui i topi si riprendono rapidamente dopo il completamento di un'acquisizione. Tuttavia, si dovrebbe fare attenzione a fornire ai topi tutto il tempo per riprendersi nelle loro gabbie e non tenere anestetizzato più a lungo del necessario. Nella nostra esperienza personale (dati inediti) i topi che venivano tenuti anestetizzati continuamente utilizzando isoflurane inalato tra il momento di 0 e 6 ore mostravano una distanza trascurabile. Allo stesso modo, è necessaria anche una dose controllata di anestetico per garantire un rapido recupero. Quando si fissa l'animale al pallet per l'imaging, il tubo fantasma utilizzato per la co-registrazione deve essere tenuto basso sullo stomaco per evitare che gli artefatti si sovrappongano ai polmoni. Allo stesso modo, per garantire un'immagine CT di qualità, fare attenzione a rimuovere eventuali tag metallici dal mouse per evitare artefatti dallo scattering a raggi X.
L'attuale protocollo MCC può essere applicato a una miriade di modelli animali. Questa tecnica ha un effetto trascurabile sulla salute dell'animale scansionato, è ben tollerata dai topi e per questo motivo può essere utilizzata con modelli di malattia senza rischiare la salute di topi già delicati. La forza di questa metodologia deriva dal fatto che si tratta di una tecnica in vivo, che consente l'acquisizione di misurazioni coerenti e ripetibili della funzione delle vie aeree senza il sacrificio degli animali alle trachee di accisa per la video-microscopia, che i modelli ex vivorichiedono 26. La coerenza di questa tecnica nella produzione di misurazioni ripetibili su più scansioni degli stessi animali consente di trattare lo stesso animale con agenti diversi o potenziali terapie e confronti statistici effettuati tra lo stesso animale per ridurre la variabilità biologica inerente a qualsiasi modello animale, riducendo così le dimensioni del campione necessarie per mostrare differenze statisticamente significative.
La valutazione della funzione delle vie aeree utilizzando la tecnica MCC può essere regolata su una varietà di modelli animali e applicata a molti diversi modelli di salute delle vie aeree, oltre a testare nuove terapie. Le vie aeree dei modelli di mouse di PCD possono essere valutate utilizzando questa tecnica, così come i modelli di BPCO. Il nostro metodo può anche essere utilizzato per studiare gli effetti differenziali di vari anestetici su MCC che sono di uso clinico comune. Infine, anche gli effetti degli agenti terapeutici sulle vie aeree possono essere valutati utilizzando questo modello. Come detto in precedenza, ma porta ripetizione, in quanto è una misurazione in vivo consente di ripetere le valutazioni MCC nel corso di una malattia, nonché i benefici di prova degli interventi terapeutici nel tempo. Inoltre, i topi sono gli animali da laboratorio più comuni utilizzati per imitare / studiare le malattie umane, con, in alcuni casi, più modelli di topi transgenici di malattie umane disponibili tra cui scegliere.

Le ciglia sono organelli cellulari a base di microtubuli conservati nella storia evolutiva dalle alghe agli esseri umani. Emanano dalle superfici cellulari e hanno una serie difunzioni 1,che vanno dal riconoscimento dei segnali sensoriali ambientali locali alla motilità, funzioni che possono essere fatte risalire dall'uomo ai primi organismi eucarioti unicellulari2,3. Cilia può essere non mobili e singola servendo come antenna specializzata di una cellula per elaborare segnali ambientali; o mobili e multipli, battendo in onde metacronali sincronizzate per generare flusso di fluido, come nel rivestimento delle tube di Falloppio e delle vie aeree superiori e inferiori, ad eccezione dei bronchioli terminali che portano agli alveoli1,2.
L'estesa superficie epiteliale delle vie respiratorie è esposta a una costante raffica di contaminazione sotto forma di una varietà di inquinanti e agenti patogeni inalati potenzialmente pericolosi, che richiedono una difesa. Un meccanismo chiave di difesa è l'apparato mucociliare dell'albero tracheobronchiale, dove un flusso continuo di muco secreto viene trasportato meccanicamente fuori dalle vie aeree dal battito di più ciglia motili che rivestono le superfici apicali delle cellule epiteliali tracheo-bronchiali. Questi funzionano per intrappolare i contaminanti inalati e, attraverso il loro battito continuo e sincronale, trasportarli cefalad4,5.
Cilia ha dimostrato di avere ruoli chiave come nello sviluppo del patterning sinistra-destra nello sviluppo di embrioni, dove le ciglia mobile al nodo embrionale romponola simmetria 6. Mutazioni nei geni correlati alle ciglia sono state collegate a malattie come la cardiopatica congenita (CHD) a causa della struttura asimmetrica del cuore6. Recenti studi hanno riportato un'elevata incidenza di disfunzione ciliare nelle vie respiratorie dei pazienti con CHD, nonché una maggiore prevalenza di complicanze respiratorie post-operatorie e sintomi cronici delle vie respiratorie nelle vie aeree superiori einferiori 7,8,9,10. I pazienti con CHD e disfunzione ciliaria, con o senza eterotassia, hanno dimostrato di avere un aumento del rischio di complicanze respiratorie e esiti respiratori negativi post-operatoriamente5,8,10. Al di là del loro ruolo nella segnalazione e nello sviluppo, l'importanza delle ciglia delle vie aeree è stata dimostrata dalle ciliopatie, di cui un primo esempio è la discinesia ciliare primaria (PCD). La PCD è un disturbo congenito derivante da una serie di mutazioni che colpiscono le ciglia respiratorie motili, portando a infezioni polmonari ricorrenti, bronchectasi e potenzialmente la necessità di trapianto polmonare11. Inoltre, anche se le ciglia sono normali nella fibrosi cistica (CF), disturbo congenito più comune nella popolazione caucasica, l'MCC è compromesso a causa di muco spesso e viscoso derivante da mutazioni nel gene CFTR12. Esistono più modelli di mouse di PCD e CF, oltre a un numero sempre crescente di modelli di CHD. In definitiva le ciglia sono strutture versatili con molti ruoli chiave e un metodo per valutare la funzione delle ciglia respiratorie mobile in vivo può essere prezioso per lo studio pre-clinico e la valutazione degli effetti delle mutazioni e dei farmaci sulla clearance mucociliare (MCC)13. Il metodo sarebbe utile anche per valutare gli effetti di nuovi farmaci, terapia genica o interventi su MCC in questi modelli di topo.
Ci sono molti modelli diversi che sono stati utilizzati per valutare MCC. Un metodo degno di nota prevede l'uso di colorante blu metilene che è stato instillato nel bronco, con gioco misurato mediante misurazione fiberottica del movimento del colorante14. Questo metodo è limitato dalla capacità di osservare il movimento del colorante, che è più routine nell'uomo che nei modelli precli clinici del topo. Un altro metodo degno di nota è l'imaging a raggi X synchrotron phase-contrast (PCXI), che può essere usato per tracciare singole particelle in una via aerea. Questo metodo è relativamente nuovo e non ampiamente accessibile15. Esistono numerosi metodi ex vivo per valutare le vie aeree mediante l'accisa di una trachea per la video-microscopia, tuttavia questi modelli forniscono poca utilità nei pazienti umani16. Le tecniche ad alta risoluzione per l'imaging delle ciglia come la tomografia a coerenza ottica sono limitate allo stessomodo 17.
In questo articolo, presentiamo un metodo riproducibile per misurare MCC in vivo che è stato utilizzato per misurare le clearance polmonari in una miriade di modelli animali, nonché studiare MCC nella broncopneumopatia cronica ostruttiva e valutare gli effetti dei farmaci immunosoppressivi18,19. Questo metodo tiene traccia della clearance del colloide radiofarmaceutico 99mtecnezio-zolfo (99mTc-Sc), un radiotracciante particolato insolubile, dopo l'instillazione nei polmoni. Il radionuclide può quindi essere tracciato utilizzando una tomografia computerizzata a emissione di fotoni singola (SPECT)18,20. Abbiamo ulteriormente perfezionato questa tecnica per misurare MCC utilizzando la doppia modalità SPECT e l'imaging di tomografia computerizzata (CT) con co-localizzazione del conteggio dei radioisotopi ai polmoni e misurando la diminuzione di questi conteggi su 6 ore. L'imaging a doppia modalità, con la co-registrazione delle immagini CT e SPECT, consente una localizzazione accurata del conteggio delle radiazioni per la nostra regione di interesse, i polmoni. Sebbene descriviamo in dettaglio il metodo per la misurazione MCC nei topi, il protocollo può essere regolato per studiare MCC nei ratti. I collimatori dovrebbero essere regolati così come la dose di radiazioni. A nostro avviso, le scansioni MCC del topo sono più tecnicamente impegnative a causa delle piccole dimensioni degli animali, ma più utili dei ratti a causa del gran numero di modelli di topi consolidati di una serie di disturbi umani. Inoltre, a causa del loro minor costo e costo di manutenzione nelle colonie animali, una dimensione del campione più grande è più fattibile nei topi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>02-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Vaporizer</td>
			<td>Vetland Medical</td>
			<td>A13480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>99150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1534477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>118-2097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Intubation Stand</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>ETI-MSE-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Anesthesia Stand</td>
			<td>Summit Anesthesia Solutions</td>
			<td>22860</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

Le ciglia traslittele respiratorie, organelli specializzati della cellula, fiancheggiano la superficie apicale delle cellule epiteliali che rivestono le vie respiratorie. Battendo in modo metacronale, sincronale, questi organelli multipli, motili, a base di actina generano un flusso di fluidi cefalodi che cancella le vie respiratorie da inquinanti e agenti patogeni inalati. Con l'aumento dell'inquinamento ambientale, nuovi agenti patogeni virali e batteri emergenti resistenti a più farmaci, la clearance mucocilia generata dalle ciglia (MCC) è essenziale per mantenere la salute dei polmoni. McC è anche depresso in molteplici disturbi congeniti come la discinesia ciliare primaria, la fibrosi cistica e disturbi acquisiti come la broncopneumopatia cronica ostruttiva. Tutti questi disturbi hanno stabilito, in alcuni casi multipli, modelli di topo. In questa pubblicazione, dettagliamo un metodo utilizzando una piccola quantità di radioattività e imaging SPECT/CT a doppia modalità per misurare in modo accurato e riproducibile MCC nei topi in vivo. Il metodo consente il recupero dei topi dopo l'imaging, rendendo possibili le misurazioni seriali e testando longitudinalmente potenziali terapie nel tempo. I dati nei topi di tipo selvatico dimostrano la riproducibilità della misurazione MCC purché venga prestata un'adeguata attenzione ai dettagli e il protocollo rigorosamente rispettato.

Utilizzando questo protocollo, abbiamo anestetizzato i topi in una camera isoflurana (Figura 1A). Dopo aver raggiunto un livello adeguato di anestesia, i topi sono stati posizionati su supporti verticali (Figura 1B) e le corde vocali sono state visualizzate utilizzando un filo guida illuminato(Figura 1C-1D). I topi sono stati intubati e instillati con 0,2 mCi 99mTc-Sc in volumi di 10 μL attraverso una cannula e topi hanno permesso di inalare spontaneamente nei polmoni (Figura 1E-1F). Dopo l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini, le immagini CT e SPECT sono state colocalizzate (Figura 2A) utilizzando il tubo fantasma come punto di riferimento (Figura 2B). Le maschere dei polmoni sono state generate dall'immagine CT (Figura 2C) e utilizzate per disegnare ROM attorno al polmone destro per l'analisi a 0 (Figura 2D) e 6 ore(Figura 2E-2F). Per testare la riproducibilità del protocollo, un totale di 8 topi sono stati scansionati due volte in giorni diversi con condizioni sperimentali identiche, con analisi che utilizzano un test t accoppiato che non mostra alcuna differenza significativa tra le scansioni ripetute (p-value=0.9904) (Figura 3A). Altri 2 topi sono stati scansionati tre volte in giorni diversi con condizioni sperimentali identiche, con un'analisi che utilizza ANOVA unidirezione che mostra una corrispondenza significativa tra le scansioni ripetute (valore p di 0,0041) (Figura 3B). In totale sono stati scansionati 8 topi e sono state visualizzate due immagini rappresentative(figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> Figura 1: Intubazione del mouse e instillazione dell'isotopo. Immagini dei passaggi necessari per intubare e infondere isotopo nelle vie aeree. A) Il mouse viene anestetizzato in una camera. B) Il mouse anestetizzato è posto su un supporto verticale, sospeso dagli incisivi anteriori. C)Un filo in fibra ottica illuminato da 0,5 mm che funge da filo guida viene preparato facendolo passare attraverso una cannula da 20 G. D) La bocca del mouse viene aperta con le forcelle e illuminata utilizzando il filo guida illuminato per visualizzare le corde vocali. E) La cannula viene spinta attraverso le corde vocali e il filo guida viene rimosso. F)L'isotopo solubile viene instillato nella cannula utilizzando una pipetta e il topo può inalare spontaneamente l'isotopo nei polmoni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> Figura 2: Immagini SPECT/CT di una scansione MCC. A) Un'immagine SPECT che è stata co-localizzata con un'immagine CT. B)Un'immagine CT con un tubo fantasma visibile utilizzato per la co-localizzazione. C) Una maschera delle vie aeree derivata binarizzando l'immagine CT ed eseguendo una proiezione di somma z-stack. D) La maschera CT co-localizzata con l'immagine SPECT. Un ROI per l'analisi è stato disegnato intorno al polmone destro. E)Una maschera delle vie aeree a 6 ore. F)Un'immagine co-localizzata CT e SPECT delle vie aeree a 6 ore con un ROI per l'analisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> Figura 3: Misurazioni di gioco degli stessi topi su più scansioni. A)Sono state misurate due autorizzazioni di ripetizione individuali per 8 topi senza variazioni nelle condizioni sperimentali. Un test t accoppiato ha mostrato che non c'era alcuna differenza significativa tra le scansioni ripetute con un valore p di 0,9904. B)Sono state misurate tre singole autorizzazioni di ripetizione per due topi senza variazioni nelle condizioni sperimentali. Un ANOVA uni-way ha mostrato che c'era una corrispondenza significativa tra le scansioni ripetute con un valore p di 0,0041. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> Figura 4: Immagini SPECT/CT colocalizzate delle vie aeree di 0 e 6 ore in 2 topi con ROM disegnate a 0 e 6 ore che delineano il polmone destro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Un video delle corde vocali illuminato da un filo in fibra ottica con l'effetto della respirazione visualizzato. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa cifra.</a>
File supplementari. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questi file.</a>

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In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

In questa pubblicazione descriviamo protocolli per la valutazione del gioco mucociliare delle vie aeree (MCC) nei topi in vivo utilizzando l'imaging a radionuclide a doppia modalità. Questo protocollo è progettato per una singola tomografia computerizzata ad emissione di fotoni (SPECT) e un protocollo di acquisizione della tomografia computerizzata (CT) utilizzando collimatori a tutto il corpo del mouse (MWB) in un doppio sistema SPECT/CT.

Valutazione in vivo del nulla osta mucociliario nei topi

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

in-vivo-evaluation-of-mucociliary-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

4.2K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine. In questa pubblicazione descriviamo protocolli per la valutazione del gioco mucociliare delle vie aeree (MCC) nei topi in vivo utilizzando l'imaging a radionuclide a doppia modalità. Questo protocollo è progettato per una singola tomografia computerizzata ad emissione di fotoni (SPECT) e un protocollo di acquisizione della tomografia computerizzata (CT) utilizzando collimatori a tutto il corpo del mouse (MWB) in un doppio sistema SPECT/CT.

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In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Ricerca

Biologia

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Valutazione della distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

Esecuzione Lavage vaginale, di colorazione viola di cristallo, e la valutazione citologica vaginale per l&#39;identificazione ciclo estrale Staging mouse

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Valutazione della Meccanica Respiratoria sistema nei topi utilizzando la tecnica delle oscillazioni forzate

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

Valutazione della funzione muscolare del muscolo estensore lungo delle dita<em&gt; Ex vivo</em&gt; E Muscolo tibiale anteriore<em&gt; In situ</em&gt; In Mouse

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo trasfezione di siRNA e Gene Knockdown in Spinal Cord via rapida non invasiva lombare spinale iniezioni nei topi

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Misurare la rigidità<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorte Utilizzando microscopia a forza atomica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...