Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health (AR-49419, DD), Distrofia Muscolare Association (DD), la formazione e la NIH sovvenzione T90DK70105 (CH).

1. Valutazione delle proprietà contrattili e passiva del vivo EDL Ex Muscle Le proprietà contrattili e passivo del muscolo EDL sono misurati ex vivo utilizzando il sistema di scientifico Aurora test muscolare in vitro. Fare riferimento alla Tabella 1 per i materiali e le attrezzature. 1.1 Materiale di preparazione <ol><li> Montare il tessuto-organo bagno assicurando il oxytube all&#39;acqua-giacca bagno tessuto. Fissare la vasca assemblata dell&#39;apparato muscolo montaggio. Collegare la linea di gas al oxytube. Fissare le linee d&#39;acqua di circolazione per l&#39;acqua-bagno giacca tessuto e posizionare la valvola a spillo nella vasca di drenaggio. </li><li> Accendere la circolazione bagnomaria e regolare la temperatura a 30 ° C 7. Lasciare 5 PSI (libbre per pollice quadrato) del 95% O CO 2 -5% 2 a fluire attraverso il oxytube. Riempire la vasca con il tampone di Ringer. Equilibrare il buffer per almeno10 min con un flusso di gas costante regolando la valvola oxytube. </li><li> Accendere gli strumenti (stimolatore, dual mode sistema a leva, e l&#39;interfaccia di segnale). Caricare il controllo dinamico del muscolo (DMC) software in base alle istruzioni del produttore. </li></ol> 1,2 dissezione del muscolo EDL Tutti gli studi su animali devono essere approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso. <ol><li> Anestetizzare il mouse con iniezione intraperitoneale di 2,5 microlitri / g di peso corporeo del cocktail anestetico (fare riferimento alla sezione materiali). Durante tutta la procedura chirurgica, la profondità della sedazione è stata verificata eseguendo un pizzico punta. Un aumento del 10% della dose iniziale anestetico viene somministrato quando necessario per mantenere l&#39;animale in anestesia. Shave dell&#39;arto posteriore. Mantenere la temperatura corporea a 37 ° C prima della procedura di dissezione posizionando il mouse su una piastra elettrica. La temperatura corporea è costantemente monitorata da misurando la temperat rettaleure utilizzando una sonda termica. </li><li> Posizionare il supino del mouse sulla scheda di dissezione (Figura 1). Togliere la pelle gamba per esporre i muscoli degli arti posteriori. Fissare la gamba sul blocco Sylgard utilizzando due perni, uno dressmaker nel piede e l&#39;altro nel muscolo gracile. Posizionare una lampada di calore sopra il corpo del mouse per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C. Costantemente superfuse tutti i muscoli a vista con tampone di Ringer. Scolare il tampone in eccesso attraverso una linea di vuoto. </li><li> Esporre il tendine distale del TA e il legamento estensore allo stereomicroscopio da dissezione la pelle verso il piede. Rimuovere delicatamente la fascia che ricopre il muscolo TA. Tagliare il legamento estensore per liberare il tendine distale TA. </li><li> Tagliare il tendine distale TA e utilizzarlo per staccare il muscolo TA. Rimuovere con cautela il muscolo TA al suo attaccamento prossimale. Posizionare un sottile pezzo di cotone tampone imbevuto di Ringer accanto al muscolo EDL di assorbire emorragia causata dalla rottura del sistema vascolare muscolo TA. Utilizzare la linea del vuoto per rimuovere il tampone in eccesso e sangue. </li><li> Legare nodi a doppio quadro seguite da un nodo ciclo usando una sutura di seta pane all&#39;incrocio tendine del muscolo (MTJ) del muscolo EDL distale (Figura 2). Fare un&#39;incisione nella porzione distale del muscolo bicipite femorale per esporre il muscolo EDL prossimale. Ripetere la stessa serie di nodi (figura 2) al MTJ del tendine prossimale EDL. Fissare il gancio braccio di leva sia al prossimale o distale i nodi con un doppio nodo quadrato utilizzando la stessa linea di sutura. Tagliare la rimanente linea di sutura. </li><li> Tagliare il tendine prossimale EDL superiore al nodo sutura prossimale. Sollevare il muscolo EDL con il gancio e tagliare la vascolarizzazione sotto il muscolo. Tagliare il tendine distale EDL inferiore al nodo sutura distale per rimuovere il muscolo EDL da dell&#39;arto posteriore. Coprire l&#39;arto posteriore esposta con un pezzo di cotone imbevuto di buffer di Ringer. </li><li> Fissare il gancio per il braccio di leva. Allineare il muscolo verticaletra due elettrodi. Fissare la linea di sutura distale al posto fisso. Sollevare il bagno tessuto di immergere il muscolo nel buffer di Ringer. Regolare la tensione di riposo di 1,0 g che utilizza una doppia grossolana / fine fase di traduzione e permettere al muscolo di equilibrare per almeno 10 min. </li></ol> 1,3 di misura delle proprietà contrattili e passivo del muscolo EDL Utilizzare la tabella 2 per impostare i parametri nel software DMC per ciascuno dei seguenti misurazioni. Analizzare i dati utilizzando l&#39;analisi dinamica muscolare (DMA) del software. 1.3.1 Misurare le proprietà contrattili del muscolo EDL <ol><li> Stimolare il muscolo EDL tre volte a 150 Hz con 60 sec a parte per stabilizzare il muscolo 8. </li><li> Stimolare il muscolo EDL a differenti tensioni di appoggio per determinare la lunghezza ottimale (Lo). La lunghezza ottimale è la lunghezza del muscolo in cui si sviluppa la tensione massima contrazione. Lasciare che il muscolorelax per 2 min. </li><li> Regolare la tensione di riposo a Lo. Misurare la forza muscolare a stimolazione contrazione singola. Determinare la forza assoluta contrazione (Pt), il tempo alla tensione di picco (TPT) e tempo di rilassamento metà (½ RT) del Pt. Lasciare che il muscolo di rilassarsi per 2 min. </li><li> Regolare la tensione di riposo a Lo. Misurare la forza tetanica muscolare generata a frequenze di stimolazione differenti (50, 80, 100, 120, 150 e 200 Hz). Determinare la forza massima assoluta muscolare tetanica (Po) in caso di forza muscolare raggiunge il massimo. Misurare la TPT e ½ RT del Po 9. </li><li> Lasciare che il muscolo di rilassarsi per 5 minuti. Regolare la tensione di riposo a Lo. Applicare 10 cicli di contrazioni eccentriche con 2 minuti di riposo tra i cicli. Calcolare la perdita relativa forza del Po dopo ogni ciclo di contrazione eccentrica. </li><li> Staccare il muscolo EDL dall&#39;apparecchio e tagliare i tendini sul sito sutura. Determinare il peso umido muscolo e calcolare l&#39;area della sezione trasversale del muscolo (CSA)6,10. </li></ol> 1.3.2 Misurazione delle caratteristiche passive del muscolo EDL <ol><li> Staccare il muscolo controlaterale EDL e collegarlo all&#39;apparecchio, come descritto nella Sezione 1.2, i punti da 2 a 7. </li><li> Oggetto del muscolo EDL a sei fasi di protocollo che si estende in cui è teso il muscolo a 160 Lo% con un incremento del 10% Lo. Analizzare la tensione-deformazione 6 Profilo. </li><li> Valutare la proprietà viscoso del muscolo EDL misurando la velocità di rilassamento stress (SRR) alle scadenze di seguito dopo l&#39;allungamento e tenendo premuto il muscolo al 10% Min: da picco a 0,1 s post-picco (pp), da 0,1 a 0,2 s pp, da 0,2 a 0,5 s pp, da 0,5 a 1s pp e da 1 a 1,5 s pp </li><li> Alla fine dello studio, eutanasia il mouse per dislocazione cervicale e / o decapitazione mentre il mouse è ancora sotto anestesia. Staccare il muscolo EDL dall&#39;apparecchio e tagliare i tendini sul sito sutura. Determinare il peso umido muscolo e calcolare il muscolo croce seArea ctional (CSA) 6, 10. </li></ol> 2. Valutazione delle proprietà contrattile del muscolo TA In situ Le proprietà contrattili del muscolo TA sono misurate con il sistema scientifico Aurora in situ test muscolare. Fare riferimento alla Tabella 1 per i materiali e le attrezzature. 2,1 Attrezzatura preparazione <ol><li> Riscaldare il termo-controllata stadio animale a 37 ° C utilizzando il ricircolo bagnomaria. </li><li> Accendere gli strumenti (stimolatore, dual mode sistema a leva, e l&#39;interfaccia di segnale). Caricare il software DMC secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 2.2 Preparazione del muscolo TA per la misura della forza in situ <ol><li> Anestetizzare il mouse, la barba l&#39;arto posteriore ed esporre il muscolo TA come descritto nei punti da 1 a 3 nella sezione 1.2. </li><li> Fate un doppio nodo quadrato intorno alla rotula legamento USIng un pane sutura seta. Fate un doppio nodo quadrato seguito da un nodo anello nella parte MTJ del muscolo TA distale (Figura 2), legare un altro doppio nodo quadrato lasciando un ciclo di ~ 10 mm dal nodo tendine distale TA utilizzando la stessa linea di sutura. Posizionare il secondo doppio nodo quadrato sul lato del circuito. </li><li> Rimuovere i perni dalla dell&#39;arto posteriore e posizionare l&#39;animale prona. Esporre il muscolo bicipite femorale. Praticare un&#39;incisione sulla linea mediana per rivelare il nervo sciatico. Fate un doppio nodo quadrato attorno l&#39;estremità prossimale del nervo sciatico. Tagliare una parte delle linee di sutura e tagliare il nervo superiore al nodo. Delicatamente, tirare il nervo sciatico verso il ginocchio utilizzando la linea di sutura e cancellare il tessuto connettivo circostante per la liberazione di ~ 5 mm della sua lunghezza. Non allungare il nervo durante questa procedura e costantemente superfuse il nervo con il tampone di suoneria. </li><li> Preparare il muscolo controlaterale TA come descritto nei punti da 1 a 3. Coprire un dell&#39;arto posteriore esposta con un pezzo di Ringer tampone imbevuto di cotone. Costantemente superfuse entrambi gli arti posteriori con pre-riscaldato (37 ° C) del buffer di Ringer. Rimuovere il tampone in eccesso attraverso una linea di vuoto. </li><li> Posizionare l&#39;animale prona sulla piattaforma animale. Fissare il supporto del morsetto ginocchio alla piattaforma animale e fissare entrambe le ginocchia al perno di metallo con doppi nodi quadrati utilizzando le linee di sutura del legamento della rotula. Pin entrambi i piedi sul blocco Sylgard con perni sarta. Per bloccare la piattaforma animale nel termocontrollata stadio. Posizionare la lampada di calore per mantenere la temperatura centrale del corpo animale a 37 ° C. </li><li> Fissare il portaelettrodo alla piattaforma animale e posare il nervo sciatico sull&#39;elettrodo utilizzando la linea di sutura. Tenere l&#39;elettrodo lontano dai muscoli degli arti posteriori. Tagliare il tendine distale TA dell&#39;arto posteriore scoperto presso il sito sutura MTJ. Fissare il tendine distale ciclo TA sutura al gancio braccio di leva. Coprire il muscolo esposta dell&#39;arto posteriore con cotone imbevuto di un tampone di Ringer caldo. </li></ol><ol><li> Utilizzare la Tabella 2 per impostare i parametri nel software DMC. Seguire lo stesso protocollo descritto nella Sezione 1.3.1 per determinare le proprietà contrattili del muscolo TA. Analizzare i dati utilizzando il software DMA. </li><li> Dopo la misurazione di proprietà contrattile, staccare il tendine distale ciclo TA sutura al gancio del braccio livellatore. Rimuovere il muscolo TA. Determinare il peso umido muscolo e calcolare il CSA 10. </li><li> Misurare le proprietà contrattili del muscolo TA controlaterale secondo i passi da 1 a 3 sopra. Euthanize il mouse secondo le linee guida istituzionali alla fine dello studio. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo protocollo, abbiamo illustrato saggi fisiologici per misurare le proprietà contrattili e passive del muscolo EDL e le proprietà contrattili del muscolo TA. Una delle principali preoccupazioni in studi di fisiologia muscolare è l&#39;ossigenazione del muscolo bersaglio. Per grandi muscoli (come il muscolo TA), il nell&#39;approccio situ è preferito perché la diffusione dell&#39;ossigeno dal buffer di Ringer non può raggiungere il centro del muscolo in un test in vitro. Nell&#39;approccio situ non disturba alimentazione normale sangue e ipossia associata effetti artificiali sono evitati. Il muscolo EDL è uno dei muscoli più comunemente usato in studio fisiologia. Un&#39;adeguata ossigenazione del muscolo intero può essere realizzato in un sistema in vitro a causa delle piccole dimensioni del muscolo. Inoltre, il sistema in vitro fornisce un ambiente chiuso per manipolare le concentrazioni di ioni (Ca 2 +, Na + e K +) e chimicicals (ATP e glucosio) che sono necessari per la generazione di forza muscolare ottimale. Questo offre una grande opportunità per studiare l&#39;effetto di queste variabili sulla produzione di forza. Misurazione accurata delle proprietà contrattili e passivo del muscolo degli arti è fondamentale per studiare la funzione del muscolo scheletrico. Cambiamenti caratteristici di queste proprietà sono spesso considerati come i tratti distintivi di varie malattie muscolari. I cambiamenti in questi parametri sono indicatori importanti per determinare se una terapia sperimentale è efficace o meno.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiale </td><td> Fabbricante </td><td></td><td> Caratteristiche e commenti </td></tr><tr><td> Tissue-organo bagno </td><td> Radnoti LLC, CA, USA </td><td></td><td> Water-jacket bagno tessuto (Cat # 158351-LL), dispersore del tubo di ossigeno (Cat # 160192), valvola Luer (Cat # 120722) </td></tr><tr><td> Circolazione bagno d&#39;acqua </td><td> Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti d&#39;America </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gas mix </td><td> Airgas Nazionale, Charlotte, Carolina del Nord, Stati Uniti d&#39;America </td><td></td><td> 95% O 2 e 5% CO 2 </td></tr><tr><td> In funzione dell&#39;apparato muscolo saggio in vitro </td><td> Aurora scientifico, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Il sistema è costituito da uno stimolatore (Model # 701A), una doppia modalità leverismo (Model # 300C o 305C), un segnale di interfaccia (Model # 604b) e un test apparatus (Model # 800A) per il montaggio in verticale organo bagno tessuto </td></tr><tr><td> Nel software muscolare saggio funzione in vitro </td><td></td><td></td><td> Dinamico il controllo muscolare (DMC) di software e di controllo dinamico di analisi dei dati muscolare (DMA) software </td></tr><tr><td> Mouse cocktail miscelati in anestesia 0,9% NaCl </td><td> Fare riferimento alle linee guida istituzionali </td><td></td><td> Ketamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / ml) e acepromazina (0,5 mg / ml). Tutta la procedura chirurgica, un supplemento del 10% della dose iniziale può essere necessario per mantenere animali sotto anestesia. </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Mondiale di precisione dello strumento </td><td> Cat # SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> Una misura plexiglas dissezione bordo </td><td> In casa progettata </td><td></td><td> Fare riferimento alla figura 1 </td></tr><tr><td> Riscaldamento lampada </td><td> Tensor Lighting Company,Boston, MA, Stati Uniti d&#39;America </td><td></td><td> 15 Lampada Watt per mantenere il caldo del mouse durante la dissezione </td></tr><tr><td> Buffer di Ringer </td><td> Le sostanze chimiche sono acquistati da Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti d&#39;America </td><td></td><td> Composizione in mM: 1.2 NaH 2 PO 4 (Cat # S369), 1 MgSO4 (Cat # M63), KCl 4,83 (Cat # P217), 137 NaCl (Cat # 217), 24 NaHCO 3 (Cat # S233), 2 CaCl 2 (Cat # C79) e 10 di glucosio (Cat # D16). Sciogliere chimici individualmente e mescolare nell&#39;ordine elencato sopra. Conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Stereo microscopio da dissezione </td><td> Nikon, Melville, NY, Stati Uniti d&#39;America </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissezione strumenti </td><td> Strumenti Scienza Fine, Foster City, CA, USA </td><td></td><td> Pinze, forbici grossa grossa, pinze sottili (dritto e 45 °) </td></tr><tr><td> Intrecciato sutura di seta # 4-0 </td><td> SofSilk USSC Suture, Norwalk, CT, USA </td><td> Cat # SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Una misura in acciaio inox gancio </td><td> Parti piccole, Inc. </td><td></td><td> 2&#39;&#39; a lungo S / S 304V (0,18 diametro&#39;&#39;) per il trasduttore di forza 305C o 2.5&#39;&#39; a lungo S / S 304V (0,012 diametro&#39;&#39;) per trasduttore 300C (Cat # ASTM A313) </td></tr><tr><td> In situ sistema di analisi della funzione muscolare </td><td> Aurora scientifico, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Il sistema (809B, in apparecchi topo situ) sono costituiti da uno stimolatore (Modello # 701B), un dual-mode leverismo (Modello # 305C), un segnale di interfaccia (Model # 604a) ed un apparato controllato pedana thermo (Model # 809A ) </td></tr><tr><td> Nel software muscolare saggio funzione in vitro </td><td> Aurora scientifico, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Dinamico il controllo muscolare (DMC) di software e di controllo dinamico di analisi dei dati muscolare (DMA) software </td></tr><tr><td> Una misura TA saggio piattaforma animale </td><td> In casa progettata </td><td></td><td> Fare riferimento alla Figura 2 </td></tr><tr><td> Una misura in acciaio inox gancio </td><td> Parti piccole, Inc. </td><td> Cat # ASTM A313 </td><td> 0.5&#39;&#39; a lungo S / S 304V (0,18 diametro&#39;&#39;) </td></tr><tr><td> Su misura elettrodi di platino 25G </td><td> Le imprese Chalgren, Gilroy, CA </td><td></td><td> A saldare due fili di platino 0,016&#39;&#39; di spessore a due fili elettrici 24G </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Materiali e attrezzature.

evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice

I movimenti del corpo sono forniti principalmente da funzione meccanica del muscolo scheletrico. Il muscolo scheletrico è costituito da fasci numerose miofibre che sono rivestite da tessuti connettivi intramuscolari. Ogni miofibre contiene miofibrille molti che corrono longitudinalmente lungo la lunghezza del miofibre. Miofibrille sono l&#39;apparato contrattile del muscolo e sono composti da unità ripetute contrattili dette sarcomeri. Un&#39;unità sarcomero contiene filamenti di actina e miosina che sono distanziati dai dischi Z e proteine ​​titin. Funzione meccanica del muscolo scheletrico è definito dalle proprietà contrattili del muscolo e passiva. Le proprietà contrattili vengono utilizzati per caratterizzare la quantità di forza generata durante la contrazione muscolare, il tempo di generazione della forza e del tempo di rilassamento muscolare. Qualsiasi fattore che influenza la contrazione muscolare (come ad esempio l&#39;interazione tra filamenti di actina e miosina, omeostasi del calcio, ATP / ADP rapporto, ecc) influenza la prope contrattileproprietā. Le proprietà passive si riferiscono alle proprietà elastiche e viscoso (rigidità e viscosità) del muscolo in assenza di contrazione. Queste proprietà sono determinate dal extracellulare e le componenti strutturali intracellulari (come titin) e tessuti connettivi (principalmente collagene) 1-2. Le proprietà contrattili e passiva sono due aspetti inseparabili della funzione muscolare. Per esempio, la flessione del gomito è compiuta dalla contrazione dei muscoli nel vano anteriore del braccio e allungamento passivo dei muscoli nel vano posteriore del braccio. Per comprendere veramente la funzione muscolare, entrambe le proprietà contrattili e passivo dovrebbe essere studiata. Le proprietà contrattili e / o passivi meccaniche di muscoli sono spesso compromesse nelle malattie muscolari. Un buon esempio è la distrofia muscolare di Duchenne (DMD), un muscolo grave deperimento causata da carenza di distrofina 3. Distrofina è una prote citoscheletricain che stabilizza la membrana delle cellule muscolari (sarcolemma) 4 durante la contrazione muscolare. In assenza di distrofina, il sarcolemma viene danneggiato dalla forza di taglio generata durante la trasmissione della forza. Questa membrana strappo inizia una reazione a catena che porta alla morte delle cellule muscolari e perdita di macchinari contrattile. Di conseguenza, si riduce la forza muscolare e miofibre morti sono sostituiti dai tessuti fibrotici 5. Questa modifica in seguito aumenta la rigidità muscolare 6. Misurazione accurata di questi cambiamenti fornisce guida importante per valutare la progressione della malattia e per determinare l&#39;efficacia terapeutica del nuovo gene / cellulare / interventi farmacologici. Qui, vi presentiamo due metodi per valutare entrambe le proprietà contrattili e passiva meccaniche del muscolo estensore lungo delle dita (EDL) muscolare e le proprietà contrattili del tibiale anteriore (TA) muscolare.

I seguenti risultati sono una rappresentazione dei nostri rapporti precedenti 6,9. I dati sono presentati come media ± errore standard della media. Tabella 3 mostra le proprietà morfometriche del muscolo EDL in BL10 normale e distrofina-deficienti (mdx) topi a 4 a 6 mesi di età. Figura 4 mostra rappresentativi proprietà contrattili e passiva del muscolo EDL da BL10 e mdx topo. Le proprietà contrattili del muscolo EDL sono descritti dai seguenti termini tra cui la specifica (forza assoluta divisa per il CSA) forza di contrazione (Figura 4A), specifica la forza tetanica massimale (Figura 4B), TPT e ½ RT dell&#39;assoluto forza massimale tetanica (Figura 4C e D). Il TPT e ½ RT può essere calcolare dalla forza di contrazione assoluta. Il profilo sforzo-deformazione (Figura 4E) e SRR (Figura 4F) unre usato per descrivere le proprietà passive del muscolo EDL. L&#39;assenza di distrofina ha un impatto significativo sulle proprietà contrattili e passivo del muscolo EDL 6,9. Twitch specifico e le forze tetaniche sono significativamente ridotti nel muscolo EDL mdx. Il TPT è significativamente più veloce, mentre il ½ RT è significativamente più lenta nel muscolo EDL mdx. Lo sforzo-deformazione profilo suggerisce che la rigidità è significativamente aumentata nel muscolo EDL mdx. Il muscolo EDL mdx produce anche una forza di resistenza significativamente molto più alto (stress passivo) prima di raggiungere la tensione di picco, mentre i post-picco sollecitazioni declinare molto più veloce. Inoltre, la SRR era significativamente superiore nel muscolo EDL mdx rispetto a quella del muscolo EDL BL10. Analisi statistica Significatività statistica tra i due gruppi è analizzato dal test t di Student. Per ssignificato tatistical tra più gruppi, Solo andata o due vie analisi ANOVA seguita da analisi post hoc di Bonferroni è consigliato l&#39;utilizzo del software SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). La differenza è considerato significativo quando p &lt;0,05. Tabella 1. Materiali e attrezzature. <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content_small"> Esperimento </td><td class="jove_content_small"> Tensione a riposo (grammi) </td><td class="jove_content_small"> Frequenza degli impulsi (Hz) </td><td class="jove_content_small"> Larghezza d&#39;impulso (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stimolazione durata (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stretch lunghezza </td><td class="jove_content_small"> Stretch durata (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stretch tasso </td><td class="jove_content_small"> Commenti </td></tr><tr><td colspan="9"> 1. La valutazione delle proprietà contrattili e passiva del vivo EDL ex muscolare </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.1 Misurare le proprietà contrattili del muscolo EDL </td></tr><tr><td> 1. Warm up </td><td> 1,0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Appoggiare il muscolo per 60 secondi tra ogni stimolo. Queste contrazioni tetaniche preliminari stabilizzare il muscolo per le misurazioni successive. </td></tr><tr><td> 2. Muscolare lunghezza ottimale (Lo) </td><td> 0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Lasciare che il muscolo di rilassarsi per 30 secondi tra ogni stimolo. Misurare la lunghezza ottimale del muscolo utilizzando un calibro digitale. </td></tr><tr><td> 3. Singolo twitch forza (Pt) </td><td> Regolare la tensione di riposo a Lo </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4. Forza muscolare tetanica </td><td> Regolare la tensione di riposo a Lo </td><td> 50, 80, 100, 120, 150 e 200 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Lasciare che il muscolo di rilassarsi per 1 minuto tra ogni stimolo. Determinare la frequenza con cui generare il massimo assoluto tetanica forza (Po). </td></tr><tr><td> 5. Contrazione eccentrica </td><td> Regolare la tensione di riposo a Lo </td><td> Usare la frequenza genera la forza massima tetanica (Po) </td><td> 0,2 </td><td> 700 </td><td> 10% Lo </td><td> ultimi 200 ms della durata di stimolazione </td><td> Lo 0,5 / sec </td><td> Ripetere la contrazione eccentrica per 10 cicli con 2 minuti di riposo tra i cicli. </td></tr><tr><td> 6. CSA del muscolo EDL </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (massa muscolare (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,44)]. 1,06 g / cm 3 è la densità muscolare e 0,44 è l&#39;EDL lunghezza della fibra muscolare a Lo rapporto. </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.2 Misurazione delle caratteristiche passive del muscolo EDL </td></tr><tr><td> 1. Sei fase di stiramento protocollo </td><td> Regolare la tensione di riposo a Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 cm / sec </td><td> Ripetere il protocollo estende con un incremento del 10% fino al 160 Lo Lo% viene raggiunto. ALOW 1,5 secondi tra i cicli di stretch. </td></tr><tr><td> 2. SRR </td><td> Regolare la tensione di riposo a Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 cm / sec </td><td> SSR è calcolato dividendo la differenza di tensione con il time trascorso tra due punti temporali in un arco di tempo. </td></tr><tr><td colspan="9"> 2,3 di misura delle proprietà contrattili del muscolo TA </td></tr><tr><td> 1. Warm up </td><td> 4.0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Appoggiare il muscolo per 60 secondi tra ogni stimolo. </td></tr><tr><td> 2. Muscolare lunghezza ottimale (Lo) </td><td> 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 e 7.0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Lasciare che il muscolo di rilassarsi per 30 secondi tra ogni stimolo. Misurare la lunghezza ottimale del muscolo utilizzando un calibro digitale. </td></tr><tr><td> 3. CSA del muscolo TA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (massa muscolare (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,6)]. 0,6 TA è la lunghezza della fibra muscolare alla Lo ratio. </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Parametri per la valutazione delle proprietà meccaniche dei muscoli EDL e TA. <table border="1"><tbody><tr><td> Tensione </td><td> Età (mese) </td><td> Peso corporeo (g) </td><td> EDL peso (mg) </td><td> Lo EDL (mm) </td><td> EDL CSA (mm 2) </td></tr><tr><td> BL10 </td><td> 6 </td><td> 32,03 ± 0,57 </td><td> 13,90 ± 0,77 </td><td> 14,09 ± 0,04 </td><td> 2,12 ± 0,12 </td></tr><tr><td> mdx </td><td> 6 </td><td> 35,44 ± 0,42 * </td><td> 16,73 ± 0,42 * </td><td> 13,93 ± 0,05 * </td><td> 2,57 ± 0,07 * </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Caratteristiche morfometriche del muscolo EDL. *, Il valore in mdtopi x è significativamente diversa da quella dei pari età BL10 topi. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in"/> Figura 1. Un diagramma schematico della misura bordo del mouse dissezione. Dissezione Il consiglio è composto da un plexiglass ½ pollice di spessore e è stato realizzato presso il negozio istituzionale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figura 2. Una serie di immagini digitali che mostrano le fasi di un nodo doppio quadrato seguito da un nodo anello nella parte MTJ. Asterisk, ilEDL muscolare, Freccia, il tendine distale del muscolo EDL. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in"/> /&gt; Figura 3. Un diagramma schematico della misura piattaforma per test in situ funzione muscolare TA. La piattaforma animale plexiglass e acciaio inox supporto del ginocchio sono stati progettati per il montaggio sul 809B in un apparecchio del mouse situ. *, Asta in acciaio inox (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, OR), #, portaelettrodo universale (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR), §, attacco di canna elettrodo (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); **, Sylgard blocco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figura 4. I risultati rappresentativi per le proprietà contrattili e passivo del muscolo EDL. Le proprietà contrattili del muscolo EDL sono caratterizzati dalla forza twitch specifico (A), la forza specifica tetanica (B), il tempo di tensione di picco (C) ed il tempo di rilassamento mezzo (D). Le proprietà passive del muscolo EDL sono valutati dal profilo sforzo-deformazione (E) e la SSR. *, I topi mdx sono significativamente diversi da pari età BL10 topi.

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Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Le variazioni muscolari degli arti proprietà contrattili e passiva meccanici sono biomarcatori importanti per le malattie muscolari. Questo manoscritto descrive test fisiologici per misurare queste proprietà nel lungo delle dita estensore murino e tibiale muscoli anteriori.

Valutazione della funzione muscolare del muscolo estensore lungo delle dita<em&gt; Ex vivo</em&gt; E Muscolo tibiale anteriore<em&gt; In situ</em&gt; In Mouse

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

41.8K Views.  University of Missouri. Le variazioni muscolari degli arti proprietà contrattili e passiva meccanici sono biomarcatori importanti per le malattie muscolari. Questo manoscritto descrive test fisiologici per misurare queste proprietà nel lungo delle dita estensore murino e tibiale muscoli anteriori.

Video: Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

In vivo micro-circolazione di misura nel muscolo scheletrico da Intra-vitale Microscopia

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Ricerca

Biologia

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Procedure di Rat<em&gt; In situ</em&gt; Proprietà muscolatura scheletrica contrattili

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Vivo Valutazione Ex della contrattilità, affaticabilità e alternanza in isolati muscoli scheletrici

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzo del metodo TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Misura di Smooth funzione muscolare nei isolato carta igienica-applicazioni Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Lesione aortica di crusca a murina: un efficace<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello di proliferazione cellulare liscia e funzione endoteliale

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

In Situ Immunofluorescenti colorazione di autofagia nelle cellule staminali muscolari

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...