Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). Questo lavoro è finanziato dal CRC for Biomedical Imaging Development Ltd, con sede e supportato in Centri di Ricerca Cooperativa il governo australiano s (CRC) del programma. LM è supportato da Melbourne di ricerca (Università di Melbourne) e borse di studio integrative Biomedical Imaging CRC. Il supporto di Monash Micro Imaging (Dr. Stephen Cody e Iska Carmichael) è stata preziosa per questo lavoro.

Preparazione delle cellule <ol><li> Umano erythroleukemic K562 cellule sono coltivate in RPMI-1640 medium supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e 20 mg / ml di gentamicina in un umidificata al 5% CO 2 ambiente a 37 ° C. </li><li> Circa 18 ore prima della colorazione lavare cellule in crescita esponenziale (ottimale a 5 x 10 5 cellule / ml) con tampone fosfato (PBS), risospendere in mezzi freschi e ritorno a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS per centrifugazione a circa 1500 rpm per 5 minuti e risospendere in mezzi freschi. </li><li> Contare le celle e regolare la densità cellulare di circa 5 x 10 5 cellule / ml. </li></ol> Le celle possono essere contati o con un metodo automatico (ad esempio Sysmex o Coulter contatore con dimensioni filtro tra 5 e 20 micron) oppure utilizzando il metodo trypan esclusione blu e un emocitometro. Il numero in eccesso di cellule (&gt; 800 cellule / cm 2) può portare a non uniforme colorazione. Irradiazione e colorazione di immunofluorescenza <ol><li> Assemblare clip cytospin, carte di filtro e diapositive con un&#39;etichettatura appropriata. </li></ol> Durante il montaggio dell&#39;apparato cytospin garantire che il foro nella carta filtro coincide con l&#39;imbuto. <ol start="2"><li> Esporre le cellule a uno γ-radiazioni o raggi X (2Gy in questo esempio). </li></ol> Per prevenire la formazione di focolai durante l&#39;irradiazione, mantenere le cellule in ghiaccio per 5 a 10 minuti prima e durante l&#39;irradiazione. A seguito di irradiazione incubare le cellule a 37 ° C, 5% di CO 2 per il tempo necessario (per i livelli di picco γH2AX 30 minuti a 1 ora, 1 ora in questo esempio). <ol start="3"><li> Lavare le cellule due volte con PBS freddo per centrifugazione e risospendere in PBS fresco. </li><li> Dispensare 100-150 microlitri della sospensione cellulare in ogni imbuto cytospin e far girare a 500 giri per 5 minuti. </li><li> Separare le diapositive da cytospins e permettono alle cellule di aria moderatamente asciutto per circa 15 minuti. </li></ol> Non lasciare che le cellule asciugare completamente la morfologia cellulare potrebbe disintegrarsi. <ol start="6"><li> Disegna un cerchio intorno alle cellule con una penna idrofobo. </li><li> Fissare le cellule con paraformaldeide 4% per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). </li></ol> Nella nostra esperienza, la fissazione con paraformaldeide è superiore a fissare con etanolo o metanolo. Cellule in sospensione richiedono la fissazione per 5 minuti a temperatura ambiente, mentre i tempi di fissazione più lunghi (15 a 20 minuti) sono necessari per il fissaggio ottimale di cellule aderenti. Troviamo che produce colorazione immediatamente risultati migliori rispetto la memorizzazione dei vetrini fissati a -20 ° C che si traduce di solito in fluorescenza di fondo elevato. <ol start="8"><li> Lavare le cellule due volte con PBS per 5 minuti ciascuno. </li><li> Permeabilize le cellule con 0,1% Triton X-100 a temperatura ambiente per 5 minuti. </li></ol> Rispetto al Tween-80 abbiamo tipicamente osservare meglio i segnali nelle cellule permeabilizzate con Triton X-100. A seconda del tipo di cellula che può essere necessario modificare il tempo di permeabilizzazione. Per esempio, in cellule K562 permeabilization per 5 minuti a temperatura ambiente è sufficiente, mentre in cellule aderenti uno permeabilization 15 minuti è richiesto. <ol start="10"><li> Lavare le cellule per tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno. </li><li> Bloccare le cellule in 1% BSA per 30 minuti (3 x 10 minuti) a temperatura ambiente. </li></ol> Abbiamo confrontato l&#39;efficienza di bloccaggio utilizzando siero (derivati ​​da specie come gli anticorpi secondari) e di BSA in PBS. BSA è stato più efficace nel ridurre al minimo legame non specifico degli anticorpi secondari rispetto al siero. Abbiamo confrontato diverse volte il blocco, il blocco durante la notte a 4 ° C rispetto a 3 x 10 minuti e 3 x 20 passi minuto blocco a temperatura ambiente, e stabilito che il blocco di 3 x 10 minuti è stato ottimale. <ol start="12"><li> Aggiungere 50 ml di anticorpo primario (1: 500 diluito in 1% BSA) per ogni diapositiva. </li></ol> Incubazione con anticorpo primario a temperatura ambiente per 60 minuti consente di ottenere la colorazione di fondo ridotto rispetto a una notte di incubazione a 4 ° C. <ol start="13"><li> Per colorare marcatori diversi contemporaneamente utilizzare anticorpi cresciuto a specie diverse (ad esempio anti-topo γH2AX e di coniglio anti-metilato H3K4 in questo esempio). </li><li> Incubare con anticorpi primari per 90 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante a 250 giri al minuto. </li></ol> Tutte le incubazioni vengono eseguite in una vasca colorazione umidificato. <ol start="15"><li> Lavare le cellule per tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno. </li><li> Aggiungere 50 ml di (1: 1000 diluito in 1% BSA), l&#39;anticorpo secondario per ogni diapositiva. </li></ol> A macchia di diversi marcatori sulla stessa diapositiva uso anticorpi secondari con dspecie specificità ifferent (secondo l&#39;anticorpo primario) e fluorescenza d&#39;onda di emissione (ad esempio anti-topo Alexa 488 (verde) e anti-coniglio Alexa-546 (rosso) in questo esempio). <ol start="17"><li> Incubare le cellule per 60 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante a 250 giri al minuto. </li></ol> Si raccomanda di incubare le cellule in una camera buia umida per evitare che sbiadiscano e asciugatura dell&#39;anticorpo secondario. <ol start="18"><li> Lavare le cellule per tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno. </li><li> Aggiungere 50 ml di (diluito 1:500 in PBS) TOPRO-3 per ogni diapositiva. </li><li> Lavare i vetrini con PBS per 3 volte 5 minuti. </li><li> Rimuovere l&#39;umidità in eccesso da diapositive e aggiungere l&#39;anti-fade soluzione. </li></ol> Si consiglia di non asciugare completamente prima di aggiungere le cellule anti-sbiadimento soluzione. <ol start="22"><li> Vetrino, sigillare con smalto e lasciare diapositive notte al buio a temperatura ambiente. </li></ol> Si raccomanda di usare confocale vetrini specifici # 1.5 (0,16-19 micron di spessore) e smalto trasparente. Pur ponendo il coprioggetto sul vetrino, occorre prestare attenzione per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. Acquisizione di immagini <ol><li> Un LSM510 microscopio confocale Zeiss Meta è utilizzato per acquisire immagini utilizzando lo standard GFP (verde, 488 nm), PI (rosso 543 nm) e laser molto rosso (blu 633 nm). </li></ol> Immagini acquisite utilizzando un microscopio confocale rivelare migliore risoluzione spaziale. Dal momento che le dimensioni del γH2AX focolai può essere inferiore a 0,5 μicrons, si raccomanda di acquisire immagini con almeno una dimensione di 0,5 μicron passo lungo l&#39;asse Z. Un olio 63 x lente ad immersione obiettivo è preferita rispetto a uno ingrandimento superiore o inferiore. Per le celle di imaging per molti focolai conteggio è preferibile utilizzare una velocità di scansione di 8 e le dimensioni dell&#39;immagine di 1024 x 1024 pixel. Per illustrare la relazione spaziale tra le diverse proteine ​​nucleari, si raccomanda di utilizzare una velocità di scansione di 6 con dimensioni immagine di 2048 x 2048 pixel. Quando l&#39;imaging da più canali una acquisizione di scansione linea è consigliato rispetto ad una scansione telaio. Questo evita lo sbiancamento e una migliore risoluzione si ottiene. Scansione sequenziale è utilizzato per prevenire sanguinare tramite tra i canali. Foci conteggio Analisi delle immagini e il conteggio focolai possono essere eseguite utilizzando vari pacchetti software (inlcuding Metamorph, immagine-J e Imaris). La procedura per il conteggio delle foci utilizzando Metamorph è descritto qui. <ol><li> Aprire stack immagine γH2AX direttamente dal menu file o utilizzando il numero di build stack di opzione. </li><li> Vai al processo del menu e scegliere aritmetica stack. </li><li> Ha scelto massima di proiezione e selezionare gli aerei da inserire e fare clic su OK. </li><li> Salvare l&#39;immagine risultante come Tiff γH2AX. file e aprire il TOPRO-3 (blu) dell&#39;immagine. </li><li> Vai a regioni e selezionare uno strumento di disegno regione e disegnare le regioni intorno nuclei. </li><li> Clicca sull&#39;immagine γH2AX Tiff e andare al menu di processo e selezionare i filtri morfologici. </li><li> Ha scelto Top-Hat e selezionare l&#39;immagine γH2AX come immagine di origine. </li><li> Applicare Top-Hat filtro e l&#39;immagine risultante sarà una immagine binaria con meno rumore e ridotta variazione di intensità fuochi. </li></ol> Si deve prestare attenzione nella scelta di Top-Hat valori. Valori ottimali può essere ottenuta con confronto visivo delle immagini prima e dopo l&#39;applicazione di filtri. <ol start="9"><li> Vai al menu di processo e selezionare l&#39;immagine soglia. </li><li> Scegli soglia inclusiva e selezionare i valori di soglia inferiori e superiori. </li></ol> E &#39;tipicamente i valori di soglia che influenzano il numero focolai. Pertanto, molta attenzione è necessaria quando la selezione di valori di soglia. Questo può essere meglio raggiunto il numero focolai conteggio utilizzando diversi valori di soglia in cellule esposte a inferiore a 2 Gy di radiazione γ-e poi confrontare i numeri con focolai conteggio manuale (ad occhio). Il valore di soglia ottimale è quella che riduce al minimo l&#39;inserimento di sfondo e massimizza inclusione di fuochi. <ol start="11"><li> Selezionare la TOPRO-3 immagine e andare al menu regioni e selezionare l&#39;opzione di trasferimento regioni. Selezionare l&#39;immagine sorgente come TOPRPO-3 e la destinazione come Top-Hat e fare clic su OK. </li><li> Una volta che le regioni nucleari vengono trasferiti al Top-Hat immagine andare al menu misurare e selezionare Analisi integrata morfometria. </li><li> Nella finestra pop-up selezionare la sorgente dell&#39;immagine-Top-Hat e misura per zona. </li><li> Seleziona misura tutte le regioni e cliccare su misura per ottenere il numero di focolai in tutti i nuclei corrispondente nella Top-Hat immagine. </li><li> I numeri focolai di ogni regione può essere esportato in un file di MS-Excel utilizzando i dati di log-opzione. </li></ol> 3Dricostruzione delle immagini Per creare un&#39;immagine 3D da una pila utilizzando Metamorph: <ol><li> Vai al menu stack e scegliete la ricostruzione 3D. </li><li> Selezionare l&#39;angolo di rotazione (ad esempio 160 °, 320 °). </li><li> Selezionare la ricostruzione 3D di tipo massimo. </li><li> Scelto il piano di rotazione (orizzontale o verticale). </li><li> Ha scelto la Z-calibrazione distanza. </li></ol> E &#39;preferibile utilizzare l&#39;utente specificato Z-distanza (ottimale è di 0,5 μicrons). <ol start="6"><li> Scegli OK per creare una ricostruzione 3D. </li></ol> Linea di scansione analisi Per l&#39;analisi linea di scansione utilizzando Metamorph: <ol><li> Aperto sia una singola immagine aereo o un file impilati. </li><li> Vai alla misura strumento barre dei comandi e selezionare la scansione analisi di linea. </li><li> Tracciare una linea attraverso il cellulare e questo verrà automaticamente rivela l&#39;intensità di fluorescenza e la distanza di ogni marcatore lungo il percorso della linea. </li></ol> Per chiarire la relazione spaziale della cromatina marcatori diversi, per esempio, γH2AX foci e la metilazione degli istoni, è preferibile disegnare linee che si estendono su regioni che sono entrambi densi e poveri di questi marcatori. Dati rappresentante Ai fini di questa dimostrazione abbiamo utilizzato anticorpi γH2AX foci e H3K4me, per valutare la distribuzione spaziale delle DSB ad un determinante epigenetico di trascrivere attivamente eucromatina. Come mostrato in figura 1, a seguito di irradiazione con 2Gy, γH2AX foci formata prevalentemente nelle regioni che sono stati spenti per entrambi colorazione H3K4me e per il DNA macchia TOPRO-3 (regioni di DNA vivacemente colorati sono indicativi di eterocromatina). <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. ΓH2AX focolai forma prevalentemente in eucromatina, in risposta alle radiazioni ionizzanti. (A) la visualizzazione di immunofluorescenza γH2AX focolai (verde) in cellule umane erythroleukemic K562, 1 ora dopo γ-irradiazione (2 Gy). γH2AX focolai sono riportati nella relazione al H3K4me, che rappresenta attivamente trascrivere eucromatina (rosso). Il DNA è marcato con TOPRO-3 (blu). L&#39;immagine fusa (blu, rosso e verde) dimostra l&#39;esclusione γH2AX focolai dalle regioni eterocromatici. L&#39;analisi di scansione di linea (fluorescenza distanza vs intensità) indica la distribuzione relativa dei marker in un unico piano. (B) Fette a piani diversi dalla ricostruzione 3D delle immagini fuse descritto in precedenza.

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals.">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li><li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation.">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp;amp, I. l. i. a. k. i. s., G, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci.">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li><li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin.">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td>
<td>Growth medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400071</td>
<td>RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20&#x03BC;g/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#x2019;-2-Ethanesulfonic Acid</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>T6146</td>
<td>Used to distinguish between live and dead cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore, USA</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>HistoneH3 (Mono-methyl K4) </td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
<td>AB8895</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>T3605</td>
<td>TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. </td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold </td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.</td>
</tr>
<tr>
<td>Polylysine slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Cytospin 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoElectron Corp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytofunnels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Cards </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PAP Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymed Laboratories, Invitrogen</td>
<td> 008877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.</td>
</tr>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

evaluation of the spatial distribution of &gamma;h2ax following ionizing radiation

Una risposta precoce molecolare a DNA a doppio filamento (DSB) è la fosforilazione della Ser-139 residui all&#39;interno del motivo terminale SQEY del 1,2 istone H2AX. Questa fosforilazione di H2AX è mediato dalla fosfatidil-inosito 3-chinasi (PI3K) famiglia di proteine, atassia telangiectasia mutati (ATM), DNA-proteina chinasi subunità catalitiche e ATM e RAD3-correlate (ATR) 3. La forma fosforilata di H2AX, denominato γH2AX, si estende alle regioni limitrofe della cromatina dal sito del DSB, formando focolai distinti, che sono facilmente visibili al microscopio immunofluorecence 3. L&#39;analisi e la quantificazione di γH2AX focolai è stato ampiamente utilizzato per valutare la formazione di DSB e la riparazione, in particolare in risposta alle radiazioni ionizzanti e per valutare l&#39;efficacia di radiazione modificando vari composti e composti citotossici 4. Data la specificità e la squisita sensibilità di questo marcatore de novo di DSB, ha fornito nuove informazioni sui processi di danno e riparazione del DNA nel contesto della cromatina. Ad esempio, nella biologia radiazione il paradigma centrale è che il DNA nucleare è l&#39;obiettivo fondamentale rispetto alla sensibilità alle radiazioni. Infatti, il consenso generale del settore è stato in gran parte per visualizzare cromatina come un modello omogeneo per danno e riparazione del DNA. Tuttavia, con l&#39;uso di γH2AX come marcatore molecolare di DSB, una disparità di γ-irradiazione indotto la formazione di focolai in γH2AX eucromatina ed eterocromatina è stato osservato 5-7. Recentemente, abbiamo utilizzato un pannello di anticorpi sia mono-, di-o tri-istone H3 metilato in lisina 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) che sono impronte epigenetiche di eterocromatina costitutiva e silenziamento trascrizionale e lisina 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), che sono strettamente correlate attivamente trascrizione regioni eucromatiche, per studiare la distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti 8. In conformità con le idee prevalenti quanto riguarda la biologia della cromatina, i nostri risultati indicato una stretta correlazione tra la formazione e la trascrizione γH2AX attivo 9. Qui mostriamo il nostro metodo di immunofluorescenza per la rilevazione e quantificazione di γH2AX focolai in cellule non-aderenti, con un focus particolare sulla co-localizzazione con altri marcatori epigenetici, analisi di immagine e di modellazione 3D.

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Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Analisi al microscopio di γH2AX focolai, che formano in seguito alla fosforilazione di H2AX a livello della serina-139 in risposta a DNA a doppio filamento, è diventato uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui abbiamo usato un anticorpo mono-istone H3 metilato in lisina 4 come marker epigenetici attivamente eucromatina di trascrizione, di valutare la distribuzione spaziale della radiazione indotta formazione γH2AX all&#39;interno del nucleo.

Valutazione della distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

evaluation-spatial-distribution-h2ax-following-ionizing

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

12.6K Views.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. Analisi al microscopio di γH2AX focolai, che formano in seguito alla fosforilazione di H2AX a livello della serina-139 in risposta a DNA a doppio filamento, è diventato uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui abbiamo usato un anticorpo mono-istone H3 metilato in lisina 4 come marker epigenetici attivamente eucromatina di trascrizione, di valutare la distribuzione spaziale della radiazione indotta formazione γH2AX all'interno del nucleo...

Video: Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

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Biologia

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

La produzione di C. elegans Transgeni attraverso recombineering con il GalK Marcatori selezionabili

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

Il Metodo Culture Slice per seguire lo sviluppo dei germi dente Espianto Cultura

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Analisi di SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation E il traffico nelle cellule umane

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

L&#39;impiego di<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imaging Whole-organo e quantitativa Istologia del tessuto per determinare la Bio-distribuzione delle molecole fluorescente

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Quantificazione dell'abbondanza del lipido e valutazione della distribuzione del lipido in Caenorhabditis elegans Nilo rosso e macchie di olio rosso O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.

Dosimetria per l'irradiazione cellulare mediante impianti a raggi X ortovolta (40-300 kV)

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

Determinazione della tossicità delle radiazioni UV e delle sostanze chimiche sulle cellule epiteliali corneali umane primarie e immortalizzate

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...