L&#39;assistenza tecnica fornita da Jaipreet Bharj. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal EU-FP7 (SYSCILIA -241.955) e The Kidney Foundation olandese (CP11.18).

Etica Dichiarazione: animali di manutenzione, allevamento, e le procedure sono definiti e controllati dagli Animali (procedure scientifiche) Act 1986. Tutti sperimentazione animale è stata effettuata sotto licenze concesse dallo Home Secretary (PIL No. 70/7892) in conformità con Biologica Servizi Management Group e il Comitato Etico Servizi biologica, SGUL, Londra, UK. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre il numero di animali utilizzati e di affinare sia le procedure e allevamento, al fine di ridurre al minimo le sofferenze e migliorare il benessere. 1. Preparazione degli strumenti, anestetici, e fluorescente Dye <ol><li> Utilizzando un estrattore micropipetta e capillari standard di borosilicato parete (senza fili) tirare aghi di lunghezza appropriata per microiniezione (Figura 1A). </li><li> Fare uno stampo agarosio per l&#39;orientamento di embrioni per l&#39;iniezione facile nel pericardio (Figura 1B). Colla circa dieci vetro microscopio slidi insieme per formare una &#39;scala&#39; di diapositive offset. Per ottenere i migliori risultati, utilizzare una goccia di rapida messa resina epossidica colla nel centro di ciascuna diapositiva. </li><li> Tagliare una sezione di circa 78 mm di lunghezza a metà due pipette 10 ml in plastica con un becco Bunsen bisturi riscaldata, rimuovere pipetta finisce a seconda dei casi. Attaccare e sezioni colla (resina epossidica) pipette ai vetrini impilati per fornire stabilità per consentire lo stampo di immergere in una capsula di Petri 90 mm. Fare ogni sforzo per garantire angoli di scorrimento allineano perpendicolare al pavimento piatto Petri. Lasciare il tempo colla per impostare. </li><li> Cast lo stampo in una soluzione di agarosio 2% made in acqua pesci (ottenuto dall&#39;acquario). Versare agarosio in un piatto 90 millimetri Petri e posizionare lo stampo sulla parte superiore del piatto Petri aperta, permettendo la diapositiva impilati bordi per immergere un angolo sotto la superficie agarosio. Lasciare impostata sul banco di laboratorio per 30 min. </li><li> Rimuovere il cast vetrino e coprire il agarosio slide-impresso con acqua il pesce frescocontenente Tricaine anestetico (vedi punto 1.9) con un rapporto di 01:25. </li><li> Fare soluzioni di rodamina destrano (RD) dye. Risospendere rodamina B 10.000 MW etichettato destrano in acqua ultrapura autoclavato a fare una scorta di concentrazione di 50 mg / ml. Per microiniezione, diluire ulteriormente il titolo ad una concentrazione finale di 5 mg / ml in acqua ultrapura autoclave. NOTA: Pigmento cellule iniziano a differenziarsi in zebrafish da 24 ore dopo la fecondazione (HPF); questi possono oscurare marcatori fluorescenti durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. </li><li> Inibire la formazione melanocita utilizzando N -Phenylthiourea (PTU), che blocca la melanogenesi attraverso l&#39;inibizione della tirosinasi. Fare una soluzione madre 0,003% di PTU sciogliendo polvere PTU in acquario, soluzione di calore a 60 ° C per solubilizzare completamente. </li><li> Incubare embrioni di zebrafish in soluzione di blu di metilene, un fungicida lieve, per evitare fioriture fungine e aumentare la sopravvivenza. Aggiungere 2 ml di blu di metilene soluzione madre, contenente 0,1% blu di metilene in uacqua ltrapure, a 1 l di acqua e l&#39;uso come mezzo embrione standard. </li><li> Portare a 15 mM concentrazione magazzino di Tricaine sale methanesulfonate / etil-3 amminobenzoato come indicato in &#39;The Zebrafish libro&#39; 23. Anestetizzare gli embrioni e di conseguenza li immobilizzato per eseguire la procedura di microiniezione. </li><li> Dopo anestetizzante gli embrioni, orientarli, per l&#39;imaging utilizzando le proprietà non-tossici e viscosi di metilcellulosa. Per fare un 200 ml preparazione di 3% metilcellulosa, chill 130 ml di acqua a -20 ° C per 30 min e posto su ghiaccio. Riscaldare 70 ml di acqua a 80 ° C in un bicchiere di vetro, aggiungere 6 g di metilcellulosa, ed agitare con una bacchetta di vetro fino a che tutte le particelle sono bagnate ed uniformemente dispersi. Aggiungere l&#39;acqua ghiacciata, mescolare, e consentire la preparazione raffreddare a 4 ° C per 30 minuti prima di aliquotando in 50 ml provette. NOTA: L&#39;abbassamento della temperatura permette la metilcellulosa di diventare solubile. La soluzione diventerà più spessacome gli idrati polvere. 3% di metilcellulosa può essere conservato senza crescita batterica per brevi periodi di una settimana a 4 ° C o più a -20 ° C. Assicurarsi che la metilcellulosa ha raggiunto RT prima dell&#39;uso. </li><li> Per eseguire iniezioni di colorante fluorescente nel zebrafish utilizzare un microiniezione set-up standard (Figura 1C). Questo consiste in un compressore d&#39;aria collegato ad un sistema regolatore di pressione che alimenta un supporto pipetta diritta per l&#39;uso con 1.0 capillari diametro esterno. Il titolare pipetta deve essere ricavato da un compatto micromanipolatore di controllo a 3 assi MM33 fissato ad una piastra di base in acciaio da un supporto magnetico. Gli embrioni possono essere visualizzati, manipolato e iniettato utilizzando un microscopio da dissezione stereo. </li></ol> 2. Zebrafish Husbandry e trattamento pre-iniezione <ol><li> Mantenere zebrafish come descritto in precedenza 23. Utilizzare un acquario set-up che fornisce l&#39;acqua di ricircolo fornita ad una temperatura costante di 28,5 ° C, Condizionati a pH 6,8-7,2 e conducibilità 450-550 mS con bicarbonato di sodio e Instant Ocean Sea Salt, rispettivamente. Utilizzare tipo selvatico o linee di zebrafish transgenici come appropriato per l&#39;esperimento, il mantenimento di una densità di 15 maschi 15 femmine per 8 L serbatoio. Impostare il fotociclo impianto pesce a 14 ore di luce del giorno tra le 09:00-23:00. </li><li> Deposizione Zebrafish comincia all&#39;inizio della fotociclo, quando le luci accendono al mattino. Per garantire il massimo delle uova possono essere raccolti senza disturbare il pesce, immergere (inserti in rete contenenti, disponibili da specialisti zebrafish) vasche di allevamento in magazzino serbatoi di tipo selvatico la sera prima della raccolta. </li><li> Il giorno della raccolta, permette 30 - 40 minuti per i pesci a deporre le uova, dopo di che raccogliere e lavare le uova con un colino da tè e acqua dell&#39;acquario fresca. Depositare le uova pulite in un terreno contenente embrione 90 millimetri piastra di Petri e incubare a 28,5 ° C. </li><li> Trattare gli embrioni con PTU inibisce melanogenesi. Alle 8 HPF, trasferire embrioni vitali in liquido minimo per piatti freschi Petri contenenti 1: 100 PTU medio embrione e l&#39;ulteriore incubare a 28,5 ° C fino 72 HPF. NOTA: PTU può causare difetti di sviluppo, se utilizzato nelle fasi precedenti così dovrebbe essere limitato a postare 8 tappe HPF, ma può essere trattata più tardi 24 HPF. Tardo aggiunta di PTU non blocca completamente la pigmentazione degli occhi, ma è generalmente efficace e inibendo la formazione del tronco melanociti. </li></ol> 3. Microiniezione NOTA: Il pericardio avvolge il cuore, ma è separato per la protezione e la facilità di movimento cardiaco fluido nella cavità pericardico. Lo scopo di questa procedura è di iniettare RD nella cavità pericardio, questo permette un rapido assorbimento del colorante al sistema vascolare. <ol><li> Aghi di carico con 6 ml - diluito RD, con punte microloader e sicuro nel supporto ago della micromanipolatore. Rompere la fine dell&#39;ago utilizzando tipp benepinza Ed (Figura 1A). Spostare la soluzione RD alla punta dell&#39;ago massimizzando durata dell&#39;impulso per l&#39;impostazione dei minuti, tornare alla msec una volta completato. </li><li> Utilizzare un micrometro, il regolatore di pressione, ed i parametri di lunghezza della punta dell&#39;ago (usando pinze) per regolare la dimensione della gocciolina espulsa a 100 micron di diametro, ciò equivale a un volume di 0,5 nl (Figura 2A). NOTA: Quando si spezza l&#39;ago, fare attenzione a non rompere troppo fuori altrimenti farà calibrare il volume di iniezione difficile. Se necessario, rompere ulteriormente la punta dell&#39;ago per aumentare la dimensione della goccia tuttavia mantenere uno spessore ago che permette l&#39;ingresso nel pericardio senza eccessiva flessione o danni al tessuto. </li><li> Prima dell&#39;iniezione anestetizzare gli embrioni in media embrione contenente Tricaine. Impostare 2 x 35 millimetri piastre Petri contenenti 5 ml di mezzo embrione, un&#39;etichetta di &#39;Tricaine&#39; e l&#39;altro &#39;Recovery&#39;. </li><li> Aggiungere 200ml di magazzino Tricaine al piatto adeguatamente etichettati. Una volta pronto per iniettare, selezionare un singolo embrione a 72 HPF e trasferire in un liquido minimo al piatto Tricaine. Monitorare l&#39;attività dell&#39;embrione, testare l&#39;embrione è anestetizzato e immobilizzato da agitazione con una punta microloader troncato. </li><li> Trasferire l&#39;embrione anestetizzato allo stampo di iniezione e orientare l&#39;embrione in un trogolo agarosio modo che il lato sinistro è rivolto verso l&#39;alto, posizionando il cuore a sinistra del campo di vista. </li><li> Per iniettare il RD nel cuore, perforare il pericardio con l&#39;ago e iniettare 1 nl del RD nella cavità pericardico dell&#39;embrione anestetizzato (Figura 2B, pannello di destra). Estrarre l&#39;ago dopo l&#39;iniezione. Trasferire l&#39;embrione iniettato nel liquido minimo per il &#39;piatto Recovery&#39; e monitor per 1 min. Trasferire l&#39;embrione individuo a un 24-pozzetti contenenti 1 ml di mezzo embrione fresco (contenente PTU) e l&#39;etichetta in modo appropriato. NOTA: Il pericardio è dura, tuttavia c&#39;è un notevole punto debole all&#39;incrocio dove il pericardio incontra gli archi faringei ventro-caudale e dorso-rostrale sacco vitellino (Figura 2B freccia). L&#39;ago deve essere diretto a questo solco. Quando l&#39;ago è in posizione, un rubinetto di un dito ferma sulla sommità del micromanipolatore faciliterà ingresso nella cavità pericardico. </li><li> Ripetere i passaggi 3,2-3,6 per almeno 10 embrioni per gruppo sperimentale, mettere ogni pesce in un pozzo separato ed unicamente labelto permesso singoli esperimenti di follow-up. Incubare a 28.5 ° C per 3 ore. </li></ol> 4. Imaging Acquisition <ol><li> A 3 ore dopo l&#39;iniezione (HPI) anestetizzare gli embrioni come precedentemente descritto e versare in un piatto 35 millimetri Petri contenente 3% metilcellulosa. Spingere delicatamente embrioni in metilcellulosa e orientare così la parte laterale può essere ripreso. </li><li> Acquisire un&#39;immagine dell&#39;embrione sotto UV, utilizzando un filtro per la visualizzazione of emessa luce a 570 nm (Figura 2C). Dopo l&#39;acquisizione delle immagini, permettono l&#39;embrione di recuperare prima di sostituire ben designato. Acquisire le immagini per tutti gli embrioni iniettati e in seguito incubare a 28,5 ° C. NOTA: In questo protocollo abbiamo utilizzato uno stereomicroscopio a fluorescenza con un set di filtri TXR, una macchina fotografica DFC300FX e relativo software applicativo. Annotare le impostazioni di acquisizione esatte per la successiva acquisizione delle immagini. </li><li> Al 24 hpi, acquisire una seconda tornata di immagini, come descritto sopra. Una volta che tutte le immagini sono state acquisite, sia a 3 e 24 HPI HPI, umanamente disporre degli embrioni o utilizzare altri mezzi sperimentali per esempio, immunoistochimica. </li></ol> Elaborazione 5. Immagine <ol><li> Quantificare intensità fluorescenza di ogni embrione iniettato, a 3 e 24 HPI HPI, analizzando le immagini utilizzando il software ImageJ del NIH. Per misurare l&#39;intensità fluorescente, aprire un&#39;immagine in ImageJ e specificare una regione di interesse (ROI) a 100 px 2 (Modifica → selezione → specificare). </li><li> Posizionare il cuore nel centro del roi (Figura 2C), impostare misure di includere media scala dei grigi e la zona (Analizza → misure set), eseguire la misurazione (Analyze → misura). Completare per ogni set di immagini, alle 3 e 24 HPI HPI, per embrioni e trasferire valori medi scala di grigi di un foglio di calcolo per ulteriori elaborazioni. NOTA: Abbiamo scelto una dimensione roi fisso pari a 100 px 2 come questo comprende cuori individuali tra embrioni. Il cuore è stato selezionato per effettuare misurazioni a causa delle dimensioni che consente una posizione comoda per misurare il contenuto di fluorescenza del sangue prima di entrare nel rene. </li><li> Eseguire l&#39;analisi statistica utilizzando appropriati software statistico. Confronta i gruppi per la significatività statistica con t-test di uno studente. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Zebrafish offrire un prezioso strumento per modellare malattia genetica umana, il loro impiego come strumento scientifico per la ricerca in vivo hanno consentito studi dettagliati sulla composizione genetica di molti sistemi biologici, tra cui il rene. Ora molto è capito su come si sviluppa il rene zebrafish e funzioni. Le somiglianze sorprendenti per nefrogenesi umana e omologia con i geni che causano malattie 21 ha illustrato come zebrafish sono diventati fondamentali per capire come difetti di fu...

Il rene umano gioca un ruolo cruciale nel filtraggio rifiuti metabolici dal sangue e il recupero soluti necessarie per sostenere l&#39;omeostasi cellulare. Ci sono un certo numero di malattie genetiche umane che causano disfunzioni renali. La malattia renale ereditaria più comune è autosomica dominante malattia del rene policistico (ADPKD) caratterizzato dallo sviluppo di fluidi riempita sacs all&#39;interno tubuli pochechnykh; i danni provocati da cystogenesis è dannoso per la funzione renale 10. ADPKD ha una occorrenza di 1: 800 - 1: 1.000 e rappresenta il 8-10% dei pazienti con insufficienza renale allo stadio terminale (ESRF) 11. Diversi geni sono stati implicati a causare ADPKD compreso policistina-1 (PKD1) e -2 (PKD2), che rappresentano circa l&#39;85% e, rispettivamente, 12,13 15% dei casi. Inoltre, i prodotti genici per PKD1 e -2 localizzano al ciglio e sono fondamentali per ciliogenesis 14,15. Vi è ora una famiglia riconosciuta di malattie genetiche umane, dettile ciliopatie, che influenzano la funzione delle ciglia e si traducono in CKD 16. Il crescente numero di malattie genetiche umane che influenzano lo sviluppo e la funzione ciliare sta disegnando interesse globale in questo organello vestigial tempo considerato. Il cilium, una sporgenza cellulare a ciglia, è arricchito con recettori e canali necessari per la trasduzione di eventi di segnalazione cellulare chiave ioni. Il cilium consiste di un axoneme basata microtubuli, tipicamente strutturato in nove doppietti microtubuli disposte radialmente con o senza una coppia centrale di microtubuli singoletto. La struttura axonemal definisce il tipo e la modalità di azione ciliare. La disposizione 9 + 2 microtubuli conferisce alla motilità cilium dove viene utilizzato nel movimento dei fluidi attraverso superfici epiteliali. La configurazione 9 + 0 non è mobili, ma si crede che soprattutto in funzione di eventi di segnalazione cellulare 17. Oltre CKD, le conseguenze della disfunzione ciliare sono un insieme di caratteristichecaratteristiche ciliopathy che comprendono, l&#39;obesità, la degenerazione della retina, polidattilia, e deterioramento cognitivo 16. Tuttavia, CKD è tra i più dannosi per la qualità della vita del paziente e quindi una forza trainante dietro lo sviluppo di adeguati modelli in vivo per ciliare correlati CKD. Il pesce zebra è un ottimo modello per comprendere l&#39;eziologia della malattia genetica umana. Il loro rapido sviluppo, la produzione di un gran numero di uova, il tessuto trasparente, e la crescita ex utero permette processi di sviluppo di zebrafish per essere visualizzati e gli eventi biologici manipolati con notevole facilità. I geni possono essere geneticamente modificati con il recente successo di strumenti di editing genoma (CRISPR 18 e Talens 19), abbattuto con antisenso tecnologia morfolino 20, o farmacologicamente regolati con l&#39;aggiunta di composti al loro ambiente acquatico. Infatti, zebrafish offrire una piattaforma di intraprendere experiments che non sono permissive in altri modelli animali. Mentre zebrafish sono vertebrati relativamente semplici (rispetto per gli esseri umani) hanno in comune molti organi funzionalmente conservati, geni e processi di segnalazione in comune con gli esseri umani. Ad esempio, il rene zebrafish è notevolmente simile in struttura e funzione rispetto agli esseri umani 21,22. Tuttavia, a differenza del rene mammiferi che si sviluppa attraverso una serie di fasi, ciascuna contrassegnata da un rene più sviluppata (Pronefro, mesonefro e metanefro), il pesce zebra embrionale si sviluppa solo pronephros, la forma più immatura di un rene. Mentre milioni di nefroni si trovano formare i mattoni del rene mammiferi, l&#39;embrione zebrafish solo possiede due. Il glomeruli, che consentono il filtrato del sangue iniziale, si fondono sulla linea mediana appena ventrale all&#39;aorta. I filtri di sangue attraverso il glomeruli nei tubuli pronephric che corrono caudalmente lungo l&#39;asse, fusione prima di uscire attraverso la cloaca. Il pronephric tubules sono fortemente ciliato con cilia motilità che sono permissive al flusso del filtrato verso l&#39;uscita caudale 3,4. Questa struttura semplice pronephric mantiene l&#39;omeostasi zebrafish attraverso diverse settimane di crescita delle larve dove alla fine si sviluppano in una più complessa struttura mesonefro 21. Tuttavia, il pesce zebra non sviluppa una metanefro 21. Nonostante le idiosincrasie zebrafish, nefrone zebrafish è segmentato con profili di espressione genica pari a quello osservato nei mammiferi e offre così un impareggiabile nel modello in vivo per nefrogenesi 3,22. Ordinariamente i pazienti sono testati per la funzione renale, attraverso una serie di esami del sangue e delle vie urinarie. Tipicamente il sangue viene analizzato per disciolto sali, urea e creatinina. Alti livelli di urea, creatinina e concentrazioni saline anomale sono indicativi di problemi con la funzione renale. L&#39;analisi delle urine utilizzando un asta colorimetrico rileva i livelli anormali di proteine, Blood, pus, batteri e zucchero in campioni di urina presente. Tali prove normalmente richiedono circa 30 ml di urina o di 5-10 ml di sangue. È stato difficile tradurre questi tipi di saggi di piccole organismi modello in vivo, come il pesce zebra, dovuta principalmente alla natura impossibile della raccolta di sangue o di urina sufficiente per eseguire il test. Qui, ci rivolgiamo la mancanza di adeguati test di funzionalità renale zebrafish e descriviamo una tecnica innovativa per il suo studio. Iniettando un colorante fluorescente nel flusso sanguigno siamo in grado di monitorare e quantificare singolarmente nel tempo la filtrazione e l&#39;escrezione di attività fluorescente dal sangue attraverso i reni. Questo metodo può essere usato per studiare il danno renale causato da malattia, cui forniamo un esempio di.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td>
			<td style="width:136px;">Intracel</td>
			<td style="width:136px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">borosilicate standard wall capillaries</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:136px;">VWR International</td>
			<td>631-0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Epoxy Resin Glue</td>
			<td style="width:136px;">Evo-Stik</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>D-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">air compressor&#160;</td>
			<td>Jun-Air</td>
			<td>OF302-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer III&#160;</td>
			<td>Parker Instruments&#160;</td>
			<td>051-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">compact 3-axis control micromanipulator&#160;</td>
			<td>Marzhauser</td>
			<td>MM33&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dissecting stereo microscope</td>
			<td style="width:136px;">Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stage micrometer&#160;</td>
			<td>Pyser- SGI</td>
			<td>02A00404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

L&#39;embrione zebrafish offre un modello per lo studio trattabili organogenesi e modello di malattia genetica umana. Nonostante la sua relativa semplicità, il rene zebrafish sviluppa e funzioni quasi nello stesso modo come gli esseri umani. Una differenza importante nella costruzione del rene umano è la presenza di milioni di nefroni rispetto al zebrafish che ha solo due. Tuttavia, semplificando un sistema così complesso in unità funzionali di base ha aiutato la nostra comprensione di come si sviluppa il rene e gestisce. In zebrafish, la linea mediana trova glomerulo è responsabile per la filtrazione del sangue iniziale in due tubuli pronephric che divergono per eseguire bilateralmente lungo l&#39;asse embrionale prima di fondersi tra loro a cloaca. I tubuli pronephric sono fortemente popolate da cilia motili che facilitano il movimento di filtrato lungo il tubulo segmentato, permettendo lo scambio di vari soluti prima infine di uscire attraverso la cloaca 2-4. Molti geni responsabili di CKD, incLuding quelli relativi alla ciliogenesis, sono stati studiati in zebrafish 5. Tuttavia, un grande inconveniente è stata la difficoltà di valutare la funzione renale zebrafish dopo manipolazione genetica. Saggi tradizionali per misurare disfunzioni renali nell&#39;uomo hanno dimostrato non traslazionale per zebrafish, dovuto principalmente al loro ambiente acquatico e le dimensioni ridotte. Ad esempio, non è materialmente possibile estrarre sangue da embrionale scena pesci per l&#39;analisi del contenuto di urea e creatinina, in quanto sono troppo piccole. Inoltre, zebrafish non produce abbastanza urine per il test su un semplice proteinuria &#39;astina&#39;, che viene spesso eseguita durante gli esami iniziali paziente. Descriviamo un test di fluorescenza che utilizza la trasparenza ottica della zebrafish per monitorare quantitativamente il passaggio di un colorante fluorescente, nel tempo, dal sistema vascolare e fuori attraverso il rene, per dare una lettura fuori della funzione renale 1,6-9.

Sindrome di Bardet-Biedl (BBS) è una ciliopathy eterogeneo rara che colpisce circa 1: 160.000 persone in tutto il mondo 16. I pazienti presentano una serie di problemi connessi compresi reni policistici, successivamente i pazienti spesso richiedono dialisi o il trapianto 24. ESRF è la causa più comune di morte in BBS, con circa il 30% dei pazienti che sviluppano CKD 16. Attualmente, 20 geni non correlati sono stati implicati in BBS senza pubblicato associazione genotipo-fenotipo. Le p...

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Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Il pesce zebra è uno strumento popolare per modellare la malattia renale cronica (CKD). Tuttavia, la loro piccola dimensione rende impossibile valutare la funzione renale con metodi tradizionali. Descriviamo un colorante fluorescente rene liquidazione test 1 che permette l&#39;analisi quantitativa della funzione renale zebrafish in CKD.

Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Views.  University College London.  Il pesce zebra è uno strumento popolare per modellare la malattia renale cronica (CKD). Tuttavia, la loro piccola dimensione rende impossibile valutare la funzione renale con metodi tradizionali. Descriviamo un colorante fluorescente rene liquidazione test 1 che permette l'analisi quantitativa della funzione renale zebrafish in CKD. 

Video: Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Ricerca

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Utilizzando la risposta optocinetico per studiare la funzione visiva del pesce zebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissezione del rene Zebrafish adulti

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Un test di screening a fluorescenza per l&#39;identificazione di modulatori Canali GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Mantenimento di un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Cage Popolazione

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...