Questo protocollo consente di valutare il meccanismo di attecchimento delle isole nel tessuto adiposo bianco. Il vantaggio principale di questo metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso è che è tecnicamente facile da replicare. Il metodo può essere applicato ad altri modelli di malattia.
Ad esempio può essere utilizzato per creare un modello murino di cancro. A dimostrare la procedura sarà Naoaki Sakata, professore associato presso l'Università di Fukuoka. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare una micro pipetta P 200 per rimuovere eventuali componenti extra delle isole dalle digestioni del pancreas, compresi i tessuti acinosi e fibrosi.
Quindi utilizzare un filtro cellulare per filtrare le singole cellule acinose. Trasferire le isole filtrate in un nuovo piatto di coltura contenente il terreno di coltura appropriato o una soluzione tampone integrata con siero bovino o albumina e ruotare il piatto per posizionare le isole al centro. Utilizzando una micro pipetta P 200, prelevare le singole isole in un tubo di raccolta appropriato.
Posizionare un nuovo filtro cellulare da 40 micrometri sopra un tubo di plastica da 50 millilitri. Utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per aggiungere le isole al filtro per separare le isole e le singole celle acinose. Utilizzare una pinza per capovolgere il filtro su un nuovo piatto di coltura non trattato da 60 o 100 millilitri contenente terreno di coltura o una soluzione tampone appropriata, integrata con siero bovino o albumina.
Utilizzare terreno fresco o tampone per lavare le isole in un nuovo piatto di coltura, quindi aggiungere abbastanza terreno o tampone al piatto di coltura per raggiungere un volume totale di circa 20 millilitri. Contare le isole al microscopio e dividere equamente il numero di isole tra le singole provette da centrifuga in plastica da 1,5 millilitri in base al numero di animali donatori. Centrifugare le isole a 2.100 G per un minuto a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
Circa 20-30 microlitri di soluzione residua rimarranno tipicamente nel tubo. Dopo aver rimosso i peli dall'addome per prevenire l'infezione, posizionare il topo in posizione supina. Dopo aver disinfettato l'addome e la regione inguinale incidono la pelle nella zona mediana inferiore, creando un'incisione cutanea lunga circa due centimetri.
Bloccare la parete addominale sinistra con pinze o divaricatori e tirare il tessuto sul lato sinistro del mouse per proteggere il campo chirurgico. Utilizzare un batuffolo di cotone per mobilitare l'intestino tenue e crasso sul lato destro del mouse. Il tessuto adiposo bianco epidermico sinistro nella cavità addominale si trova nella zona inguinale sinistra.
Mobilitare il tessuto adiposo bianco epidermico e il testicolo sinistro all'esterno dell'addome e allungare il tessuto. Utilizzare una micropipetta P 200 per raccogliere l'intero volume di isole da un tubo da 1,5 millilitri, facendo attenzione che nessuna isoletta rimanga nel tubo al momento della raccolta. Lasciare che le isole raccolte si depositino nella punta della pipetta per gravità.
Posizionare leggermente la punta della micro pipetta sul tessuto adiposo disteso, avendo cura di evitare un eccessivo lavaggio del mezzo o tampone nella punta. Seminare con cura le isole sul tessuto. Dopo la semina, confermare il corretto posizionamento delle isole sotto un microscopio da dissezione.
Coprire le isole con il tessuto adiposo bianco epidermico, quindi posizionare il testicolo sinistro sotto il tessuto adiposo bianco episomiale e riportare i tessuti nella cavità intraperitoneale. Chiudere la pelle in due strati usando una sutura 4-o. Al termine, posizionare il mouse sotto una lampada di calore e monitorarlo fino al completo recupero.
Per confrontare l'efficacia del trapianto di isole coperte di grasso con quella dopo il trapianto intraperitoneale di isole, lo stesso numero di isole è stato impiantato sul peritoneo nello spazio paracolico sinistro degli animali diabetici riceventi di controllo. I livelli di glucosio nel sangue dei topi con trapianto di isole ricoperte di grasso sono stati osservati diminuire gradualmente e significativamente rispetto ai topi trapiantati di isole intraperitoneali. Il test di tolleranza al glucosio intraperitoneale è stato eseguito un mese dopo il trapianto.
La glicemia nei topi con trapianto di isole ricoperte di grasso è stata mantenuta a livelli inferiori rispetto a quelli osservati nei topi trapiantati di isole intraperitoneali. L'esame istologico è stato utilizzato per valutare l'attecchimento delle isole nel tessuto adiposo bianco epidermico. Negli animali riceventi di trapianto di isole ricoperte di grasso, la colorazione eocenica dell'ematossilina ha rivelato la presenza di isole all'interno del tessuto adiposo bianco epidermico.
Inoltre, la colorazione anticorpale coniugata con fluorescenza delle isole insulinopositive ha facilitato la rilevazione di microvasi positivi al fattore di von Willebrand all'interno del tessuto adiposo bianco epidermico di tutti i topi riceventi. Per avere successo con questa procedura, assicurarsi di lasciare che le isole si depositino completamente sulla punta della pipetta e seminarle sul tessuto adiposo senza versarle.
