Questo protocollo è stato utilizzato per oltre 40 anni e rimane l'unico metodo affidabile per i test di trapianto di cellule mammarie nel ratto. Questo metodo è ampiamente usato per interrogare gli effetti autonomi delle cellule mammarie rispetto agli ospiti nella ricerca sulla suscettibilità al cancro al seno. Innestando nel cuscinetto di grasso interscapulare, questo metodo evita di dover cancellare l'epitelio della membrana endogena che non è efficace nei ratti.
Il metodo è quindi meno invasivo e le ghiandole mammarie endogene possono essere utilizzate come controllo interno. Per iniziare questa procedura, posizionare un topo femmina eutanasiato sulla schiena e fissarlo con spilli. Spruzzare l'intera superficie ventrale con il 70% di etanolo.
Fai un'incisione a forma di Y sagittale che consente l'accesso a ghiandole mammarie toraciche, addominali e inguinali. Usa le forbici per sezionare tutto il tessuto della ghiandola mammaria dal ratto donatore e rimuovere tutti i linfonodi visibili. Quindi, utilizzare le forcelle per estrarre il tessuto mammario.
Posizionarlo in un piatto etichettato da 60 millimetri contenente 500 microlitri di supporti DMEM F12 senza siero e tenerlo sul ghiaccio. Quindi usa le forbici per tritare finemente il tessuto mammario. In primo luogo, girare attentamente il corpo dell'animale donatore per posizionarlo in una posizione incline e fissarlo con i perni.
Spruzzare la testa e la parte superiore della schiena con il 70% di etanolo. Individuare la base del cranio e fare un'incisione sotto i condili occipitali, inserire forbici affilate sotto la pelle e tagliare la pelle lontano dal cranio compresi i lati della testa. Successivamente, utilizzare tagliatori ossei o forbici forti per tagliare il cranio lungo la linea mediana dalle ossa occipitali a quelle frontali, assicurandosi di mantenere la lama il più superficiale possibile e inclinata verso l'alto per prevenire la distruzione del tessuto cerebrale sottostante.
Usa Rongeurs o forti forcep per staccare l'osso. Inserire l'utensile lateralmente al cervelletto per rompere l'osso su entrambi i lati. Sever i collegamenti con le meningi esponendo completamente il canale uditivo.
Usa le forcep curve a punta fine per sollevare il cervello dal cranio e registrarne il peso. Usa un nuovo inizio di rifornimenti per ulteriori cervelli donatori. Trasferiscilo immediatamente in un tubo da 15 millilitri contenente una quantità uguale di supporto che viene immagazzinato sul ghiaccio.
Omogeneizzare il cervello per 10-15 secondi a bassa velocità. Quindi filtrare l'omogeneato per rimuovere pezzi di grandi dimensioni. Conservare il liquido sul ghiaccio fino a quando necessario.
Per prima cosa, tagliare un centimetro dall'estremità di una punta della pipetta da 1.000 microliter e posizionarlo manualmente sul pipettor. Utilizzare una punta di pipetta tagliata per trasferire il tessuto donatore tritato da ogni piatto da 60 millimetri al tubo di digestione della collagenasi. Mescolare delicatamente il tessuto tritato tubazione su e giù da una a due volte.
Quindi fissare i campioni in posizione orizzontale nell'incubatore di scuotimento. Lasciare digerire i campioni per 1,5-2 ore a 37 gradi Celsius mentre si tremano a una velocità compresa tra 200 e 220 giri/min. Quando il tessuto della ghiandola mammaria del donatore è completamente digerito, centrifugare la sospensione a 1.200 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Dopo aver assicurarsi che si sia formato un pellet, utilizzare una pipetta per rimuovere lo strato di grasso o versare con cura il supernatante. Riutilizzare delicatamente il pellet in 10 millilitri di supporti DMEM F12 freschi. Ripetere questo processo per lavare accuratamente le cellule.
Preparare un tubo da 50 millilitri con un colino da 40 micrometri per ogni animale donatore. Pre-bagnare il colino con almeno un millilitro di supporti DMEM F12. Quindi utilizzare una pipetta per passare la sospensione cellulare attraverso il filtro per raccogliere frammenti duttali o organoidi.
Per gli organoidi, mantenere solo le celle che rimangono nel filtro. Invertire il filtro cellulare su un nuovo tubo da 50 millilitri e risciacquare con qualsiasi volume di mezzi sterili necessari per raccogliere tutte le cellule. Dopo questo, pellet le cellule ancora una volta e rimorsi in un piccolo volume di mezzi per il conteggio.
Preparare singoli lotti di materiale donatore per tutti i riceventi del trapianto combinando volumi uguali della sospensione cellulare con omogeneato cerebrale al 50% per ogni sito di trapianto. In primo luogo, identificare la base del cranio e l'inizio della colonna vertebrale su un animale ricevente. Circa un terzo della strada lungo la colonna vertebrale, radersi un'area di tre centimetri per due centimetri sulla parte toracica superiore della schiena.
Successivamente, preparare il campo sterile che verrà utilizzato per l'intervento chirurgico e organizzare tutte le forniture necessarie. Sciacquare le siringhe Hamilton con mezzi DMEM F12 sterili per evitare la perdita di cellule. Caricare l'intero volume di materiale donatore in una siringa separata per ogni condizione.
Dopo che la siringa è stata completamente caricata, invertirla e premere leggermente lo stantuffo per rimuovere le bolle d'aria sulla punta dell'ago. Tenere la siringa sul ghiaccio per tutta la procedura. Assicurarsi che l'animale rimanga insensinte agli stimoli profondi con un dito fermo.
Quindi utilizzare una lama chirurgica affilata per fare una piccola incisione interscapulare. Individuare il vaso sanguigno mediale per l'orientamento e utilizzare le forcep per sollevare la pelle su un lato dell'incisione. Tenere la pelle lontana dal cuscinetto grasso ed evitare il grasso bruno sottostante durante l'eseguito il trapianto.
Quindi, inserire l'ago nel sito di innesto. Iniettare con cura 40 microlitri della miscela cellulare nel tessuto interscapulare del cuscinetto adiposo bianco. Rimuovere lentamente l'ago.
Tenere il tessuto in posizione e consentire alle cellule trapiantate di depositarsi per tre o cinque secondi. Ripetere l'intera procedura di iniezione come descritto in precedenza nel secondo sito di trapianto. Successivamente, chiudere la ferita chirurgica usando clip o suture della ferita e quindi interrompere l'anestesia.
Dopo aver sacrificato l'animale, preparalo per la dissezione. Identificare il vaso sanguigno mediale che separa i siti di innesto nel cuscinetto di grasso interscapulare. Asportare l'intero cuscinetto come un singolo pezzo di tessuto.
Posizionare il tessuto su uno scivolo al microscopio caricato positivamente per l'intero supporto. Posizionare le diapositive in etanolo al 70% per sette-10 giorni per disgrassare il tessuto. Quindi preparare la macchia di carminio dell'allume ed elaborare le diapositive quando il tessuto è sufficientemente opaco.
Quando l'elaborazione è completa e il tessuto sullo scivolo si è cancellato, utilizzare la microscopia a bassa potenza o la fotografia digitale ad alta risoluzione per acquisire immagini delle diapositive per l'analisi. In questo studio, le cellule epiteliali mammarie vengono trapiantate utilizzando una tecnica ottimizzata per lavorare con ratti in cui gli organoidi epiteliali mammari isolati dai ratti donatori sono innestati nel cuscinetto di grasso bianco interscapulare dei ratti riceventi. La presenza, l'assenza o l'abbondanza di epitelio possono essere valutate per determinare il successo dell'esperimento così come l'autonomia degli effetti relativi alle variabili sperimentali.
Un esperimento di trapianto reciproco in cui ogni fattore ha due livelli come il tipo selvaggio rispetto al knockout creerà quattro gruppi di trapianti per il test delle ipotesi. Il cuscinetto di grasso interscapulare intero rappresentativo mostrato qui contiene una crescita epiteliale positiva in entrambi i siti di trapianto. Quando si analizzano le diapositive, la mancanza di epitelio nel cuscinetto di grasso interscapulare su molti campioni può indicare un problema tecnico con la procedura e deve essere trattata come un risultato negativo.
La crescita epiteliale del donatore può anche essere paragonata alla ghiandola mammaria endogena e può facilitare ulteriori conclusioni. Nell'esempio qui mostrato, i risultati del trapianto reciproco utilizzando ratti knockout di tipo selvaggio e CDKN1B hanno suggerito effetti autonomi delle cellule non mammarie sullo sviluppo della ghiandola mammaria. Ricorda che le cellule epiteliali e gli organoidi del donatore devono essere preparati con cura e tenuti in vita fino a quando non vengono iniettati nell'animale ricevente.
È imperativo pianificare in anticipo ed eseguire la procedura con attenzione e senza interruzioni. I test di cancerogenesi primaria possono essere eseguiti dopo il trapianto per interrogare l'autonomia delle cellule mammarie nell'eziologia o nel trattamento del cancro al seno. L'editing genico può anche essere incorporato per ingegnerizzare geneticamente le cellule donatrici o il ratto ricevente.
Come unico metodo per eseguire il trapianto di cellule epiteliali mammarie nei ratti, questa procedura facilita lo sviluppo della ghiandola mammaria e gli studi sulla cancerogenesi. Questa tecnica è particolarmente importante per la ricerca delle interazioni tra le cellule tumorali del seno e/o le cellule epiteliali mammarie con il microambiente ospite. Consente studi nello sviluppo della ghiandola mammaria e nella ricerca sul cancro al seno.
Coloro che tentano questa tecnica per la prima volta dovrebbero ottimizzare i preparati cellulari del donatore per garantire la massima resa e vitalità delle cellule, quindi eseguire piccoli esperimenti pilota per praticare procedure chirurgiche e determinare il numero di cellule da iniettare e anche determinare i tempi di incubazione post-chirurgica necessari per gli esperimenti.
