In-Nucleus Hi-C nelle cellule di Drosophila

I protocolli Hi-C del nucleo consentono l'esplorazione della conferma cromosomica a diversa risoluzione per la caratterizzazione di loop, domini e compartimenti cromatici che organizzano il genoma. Questo protocollo fornisce una profilazione ad alta risoluzione delle interazioni genomiche a diverse scale, producendo una copertura più coerente sull'intera gamma di distanze genomiche e dati con meno rumore tecnico. La combinazione di questo protocollo con l'editing genetico è una potente strategia per testare la funzione strutturale degli elementi genetici.

Può anche essere applicato alla caratterizzazione delle variazioni strutturali che portano alla malattia. Il protocollo Hi-C del nucleo può essere applicato per esplorare l'organizzazione del genoma di qualsiasi genoma eucariotico. Il trattamento SDS e Triton disaggrega eventuali grumi nucleari mediante pipettaggio poiché gli aggregati interferiscono con l'efficienza della reazione enzimatica e assicurarsi di eseguire la misura di controllo di qualità appropriata prima del sequenziamento.

Iniziare aggiungendo formaldeide priva di metanolo a una volta 10 alle sette cellule Di Drosophila Line 2 Plus di Schneider in 17,5 millilitri di mezzo Schneider integrate con il 10% FBS a una concentrazione finale del 2%Incubare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente mescolando ogni 60 secondi o su una ruota rotante e aggiungere glicina a una concentrazione finale di 0,125 molari con la miscelazione. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente e 15 minuti su ghiaccio, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risusciere accuratamente il pellet in 25 millilitri di PBS freddo e raccogliere le celle con un'altra centrifugazione. Alla fine della centrifugazione, risuscise le cellule in un millilitro di tampone di lisi ghiacciata per il conteggio e regola le cellule a una volta 10 alla concentrazione di sei celle per millilitro.

Incubare le cellule sul ghiaccio per 30 minuti, invertendo il tubo ogni due minuti per mescolare e raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione. Risuspenare il pellet in un millilitro di tampone di lisi ghiacciata fresca. Dopo la centrifugazione, lavare il lisato con un millilitro di tampone di restrizione 1,25X.

Centrifugare nuovamente per raccogliere il lisi. Rinsociempere il pellet in 360 microlitri di tampone di restrizione fresco e 11 microlitri di 10% SDS con un accurato pipettaggio e incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius e da 7 a 950 giri al minuto con pipettaggio occasionale. Al termine dell'incubazione, interrompere la permeabilizzazione con 75 microlitri di tensioattivo non ionico e riportare il tubo all'incubatore per ulteriori 45 minuti con agitazione a 950 giri al minuto con pipettaggio occasionale.

Per la digestione della cromatina, aggiungere 200 unità di Mbo1 al tubo per un'incubazione da quattro a 16 ore a 37 gradi Celsius con rotazione. Alla fine dell'incubazione, inattivare l'enzima con incubazione di 20 minuti a 60 gradi Celsius. Per riempire le sporgenze del frammento di restrizione ed etichettare le estremità del DNA con biotina, aggiungere 1,5 microlitri ciascuno di 10 millimolari dCTP, dGTP, dTTP, 20 microlitri di 0,4 millimolari biotina dATP, 17,5 microlitri di tris basso tampone EDTA e 10 microlitri di cinque unità per microlitro di DNA polimerasi un grande frammento al tubo con un'attenta miscelazione.

Incubare la reazione per 75 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione a 700 giri al minuto ogni 10 secondi per 30 secondi. Alla fine dell'incubazione, aggiungere la miscela di legatura alla cromatina e regolarla a un millilitro di volume di reazione finale con un'accurata miscelazione delicata e incubare durante la notte a 16 gradi Celsius. Per degradare le proteine del campione, aggiungere 50 microlitri di 10 milligrammi per millilitro proteinasi K al tubo per un'incubazione di due ore a 37 gradi Celsius.

Alla fine dell'incubazione, aumentare la temperatura a 65 gradi Celsius durante la notte per invertire la reticolazione del campione. La mattina successiva, degradare l'RNA con 10 microlitri da 10 milligrammi per millilitro RNAsi A.Dopo un'ora a 37 gradi Celsius, aggiungere un volume di cloroformio fenolica al tubo e mescolare accuratamente per inversione per ottenere una fase bianca omogenea. Dopo aver precipitato il DNA secondo protocolli standard, quantificare il DNA utilizzando un colorante fluorogenico che si lega selettivamente al DNA e un fluorometro secondo le istruzioni del produttore.

Per purificare il DNA da aliquote non digerite e digerite, caricare 100 nanogrammi di campioni non digeriti, digeriti e ligati su un gel di agarosio all'1,5% e cercare uno striscio centrato su 500 coppie di basi nel campione digerito rispetto a una banda ad alto peso molecolare per il campione legato. Per verificare l'efficienza di marcatura e legatura Hi-C mediante amplificazione e digestione di un'interazione nota, dopo PCR, digerire i prodotti con Mbo1, Cla1 o entrambi ed eseguire i campioni su un nuovo gel da 1,5 a 2% per consentire la stima del numero relativo di giunzioni di legatura 3C e Hi-C. Dopo aver sonicato il campione per ottenere da 200 a 500 frammenti di DNA a coppia di basi, trasferire 130 microlitri con cinque microgrammi di DNA da ciascun campione in nuovi tubi microcentrifuga contenenti 16 microlitri di tampone di legatura 10X, due microlitri di dATP da 10 millimolari, cinque microlitri di DNA polimerasi T4 e sette microlitri di acqua doppia distillata per un'incubazione di 30 minuti a 20 gradi Celsius.

Alla fine dell'incubazione, aggiungere cinque microlitri di 10 dNTP millimolari, quattro microlitri di tampone di legatura 10X, cinque microlitri di polinucleotide chinasi T4, un microlitro di DNA polimerasi un grande frammento e 25 microlitri di acqua doppia distillata ai tubi per una seconda incubazione di 30 minuti a 20 gradi Celsius. Per selezionare i frammenti principalmente nell'intervallo di dimensioni della coppia di basi da 250 a 550, eseguire la selezione sequenziale della fase solida reversibile e della dimensione di mobilizzazione con 0,6X, quindi 0,9X secondo le istruzioni del produttore ed eluire il DNA con 100 microlitri di tris basso EDTA. Per il pulldown della biotina per ogni libreria, lavare 150 microlitri di perle magnetiche legate alla streptavitina due volte con 400 microlitri di tampone 1X Tween e ruotare i campioni per tre minuti su una ruota rotante.

Al termine dell'incubazione, rispesciare le perle in 300 microlitri di tampone 2X no Tween e mescolarle con 300 microlitri di materiale Hi-C per una rotazione di 30 minuti su una ruota rotante. Alla fine dell'incubazione, lavare le perle con 400 microlitri di tampone 0,5X Tween per un'incubazione di tre minuti a 55 gradi Celsius e 750 giri al minuto, seguiti da due lavaggi in 200 microlitri di tampone di restrizione 1X per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, risuscie le perle in 100 microlitri di miscela di coda dATP per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, risuscimere le perle in 50 microlitri di tampone di legatura 1X e trasferire la sospensione in un nuovo tubo contenente quattro microlitri accoppiati pre-ricotti accoppiati e due microlitri di T4 ligasi. Dopo due ore a temperatura ambiente, rimuovere il surnatante e lavare le perle due volte con 400 microlitri di buffer Tween, quindi lavare le perle una volta con 200 microlitri di nessun buffer Tween e una volta con 100 microlitri di buffer di restrizione prima di ri-sospendere le perle in 40 microlitri di buffer di restrizione 1X. Uno striscio da 200 a 1.000 coppie di basi si osserva quando la restrizione con Mbo1 ha successo.

Se la legatura ha successo, si osserva una fascia ad alto peso molecolare nella parte superiore del gel. L'efficienza della digestione può anche essere confermata dalla PCR quantitativa. Un'efficienza di digestione accettabile è dell'80% o superiore.

Come illustrato, l'amplificazione di un'interazione nota a medio raggio nei prodotti di legatura Hi-C può essere stimata mediante digestione del prodotto PCR recuperato nell'amplificazione. Si raccomanda un'efficienza di digestione superiore al 70% per evitare di avere una grande percentuale di letture non utili per le librerie dopo il sequenziamento. Il numero di cicli pcr per l'amplificazione finale dovrebbe essere un ciclo inferiore al numero di cicli per i quali lo striscio è visibile.

Il livello di digestione della biblioteca indica l'abbondanza di coppie Hi-C valide e riflette la proporzione di letture utili che si otterranno dalla biblioteca. Utilizzando le coppie Hi-C valide univoche, è possibile eseguire l'analisi di base della distribuzione delle coppie. Come osservato in questo esempio rappresentativo, il locus del gene NOTCH può essere visto insieme alle proteine architettoniche, ai domini uno e due e alle modificazioni istoniche lungo il locus.

Dopo la delezione della regione contenente entrambi i siti di legame del DNA CTCF e M1BP, si può osservare un drammatico cambiamento nei contatti con la cromatina. Dopo l'esperimento Hi-C, è possibile eseguire un'comunicazione per raggiungere un insieme specifico di contatti, ad esempio dalle regioni del promotore. Ciò è particolarmente utile quando si valutano genomi di grandi dimensioni.

Come dimostrato, la combinazione del protocollo Hi-C con l'aggiunta genetica può essere utilizzata per valutare la funzione strutturale e regolatoria degli elementi genomici.