Questo metodo consente un'analisi trascritomica di una rara popolazione cellulare proveniente dalla ghiandola accessoria maschile drosofila, chiamata cellule secondarie, e scopre geni che li rendono fondamentali per il successo riproduttivo. Nel corso di un giorno, questa tecnica consente lo smistamento di cellule secondarie da diversi genotipi e l'estrazione dell'RNA totale per il successivo sequenziamento qPCR o RNA. A volte i progetti sono limitati dalla rarità della materia prima.
Questo metodo può fornire la base per altri gruppi che affrontano la sfida di lavorare con una popolazione cellulare rara. Poiché la procedura deve accumulare 40 ghiandole, è importante praticare le dissezioni. Anche preparare le punte di pipetta fatte in casa è importante, quindi dovresti visualizzarlo sul video come farlo e prepararlo in anticipo.
Prima di iniziare la procedura, tagliare e fiammare punte rotonde, larghe, da 200 microliter per la gestione delle ghiandole e passare l'apertura della punta di più punte di 1.000 microliter vicino a una fiamma per meno di un secondo per restringere le aperture. Quindi, ordina le punte modificate da più strette a più larghe in base alla loro velocità di aspirazione. Per la dissezione della ghiandola accessaria, mettere da 20 a 25 Drosophila maschi in un piatto di vetro sul ghiaccio e utilizzare le forcette e un microscopio a dissezione per rimuovere il tratto riproduttivo di una mosca maschile.
Cancellare la coppia di ghiandole accessorie da tutti gli altri tessuti, compresi i tester e il bulbo eiaculatorio, e trasferire le ghiandole accessorie su una piastra di vetro contenente mezzo integrato nel siero a temperatura ambiente. Quando sono state raccolte 20 paia di ghiandole accessorie, lavare le ghiandole in un piatto di PBS per uno o due minuti a temperatura ambiente. Alla fine del lavaggio, trasferire le ghiandole in una soluzione di dissociazione preparata al momento e utilizzare forcep affilate sotto un microscopio sezionante per pizzicare saldamente il centro di un lobo ghiandolare.
Usando una seconda coppia di forcelle, tagliare il tessuto con la punta affilata per separare la regione prossimale della ghiandola accessoria e il condotto eiaculatorio dalla porzione della ghiandola contenente cellule secondarie. Tagliare le ghiandole in modo che le peptidasi possano raggiungere le cellule che sono altrimenti protette dallo strato muscolare esterno e dal liquido seminale viscoso nel lume della ghiandola. Quindi, utilizzare una punta di pipetta pre-bagnata, arrotondata alla fiamma, larga, da 200 microlitri per trasferire le ghiandole in un tubo da 1,5 millilitri.
Per la digestione dei tessuti, posizionare il tubo in uno shaker Celsius di 37 gradi per 60 minuti a 1.000 rotazioni al minuto. Alla fine dell'incubazione, interrompere la digestione con un millilitro di mezzo integrato nel siero e utilizzare una punta di pipetta pre-bagnata, arrotondata alla fiamma, larga, 1.000 microliter per trasferire i campioni su una piastra da 24 pozzetto. Controllare le cellule per la loro espressione GFP al microscopio fluorescente.
La maggior parte delle punte della ghiandola dovrebbe sembrare intatta e alcune cellule secondarie dovrebbero essere staccate. Utilizzare una punta arrotondata, stretta, da 1.000 microliter per triturare delicatamente le cellule da tre a cinque volte per interrompere il tessuto della ghiandola accessoria. Quindi, utilizzare una punta di pipetta molto stretta, arrotondata, da 1.000 microliter una a due volte per personalizzare le cellule.
Lasciare che le cellule si sistemino per 15 minuti. Verificare che le cellule appaiano sane al microscopio e rimuovere il mezzo in eccesso. Quindi, trasferire le cellule in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e risciacquare i pozzi con mezzo fresco per recuperare eventuali cellule rimanenti.
Il costrutto Abd-B-GAL4 può essere usato in questi esperimenti per etichettare le cellule secondarie ma non principali con GFP. In questo studio, entrambi i tipi di cellule sono stati ordinati da ghiandole accessorie mutanti di tipo selvaggio e iab-6cocuD1. Questo mutante D1 manca dell'espressione delle trascrizioni Abd-B e MSA, che influenzano lo sviluppo, la morfologia e la funzione delle cellule secondarie.
Dopo la dissociazione cellulare, facs viene utilizzato per selezionare cellule viventi basate su DRAQ7, e il livello di fluorescenza GFP viene utilizzato per isolare le cellule secondarie e le cellule principali. L'RNA viene estratto da ogni popolazione cellulare e adattato a due nanogrammi per campione per il successivo RT-qPCR e sequenziamento. La quantificazione dell'espressione di geni specifici mediante PCR quantitativa in tempo reale su estratti cellulari principali e secondari di tipo selvatico rivela che i geni delle cellule secondarie Rab19 e MSA sono rilevati solo da estratti di cellule secondarie, mentre il peptide sessuale del gene cellulare principale viene rilevato solo da campioni di cellule principali.
L'analisi dei componenti principali sui dati di sequenziamento dell'RNA di tre tipi selvatici e tre repliche mutanti rivela che il tipo selvaggio replica entrambi gli ammassi vicini l'uno all'altro e lontano dai campioni mutanti. La visualizzazione di letture allineate a particolari geni mostra che i geni delle pulizie come l'actina 5C e i geni secondari specifici delle cellule Rab19 e Dve sono espressi in entrambi i genotipi. Per la MSA, tuttavia, la forte espressione del gene osservato nelle mosche di tipo selvatico si perde nei ceppi mutanti.
Ottenere abbastanza cellule secondarie dissociate viventi è importante per una procedura di successo. Pertanto, verificare il protocollo di dissezione e dissociazione nell'esperimento su piccola scala. Questo metodo consente lo smistamento di entrambi i tipi cellulari di ghiandola accessoria da un piccolo numero di mosche, consentendo lo studio di come quelle cellule reagiscono trascrittamente a più condizioni genetiche o ambientali.
Il successo riproduttivo maschile è noto per essere influenzato da molte cose, tra cui genotipo, età e stato di accoppiamento. La facilità di questo metodo dovrebbe consentirci di indagare come questi fattori influenzano la trascrizione della ghiandola accessoria.
