Il nostro protocollo può essere utilizzato per determinare eventi dinamici spaziali e temporali durante la mitosi e può anche essere utilizzato per visualizzare gli effetti dei regolatori miotici in tempo reale. L'uso dell'imaging a doppio colore consente un'analisi simultanea di due marcatori molecolari. Ad esempio, possiamo visualizzare i microtubuli del mandrino miotico e la struttura cinetica del nucleo dei cromosomi replicati.
Per indurre l'espressione proteica fluorescente, quattro giorni dopo il trattamento di interferenza dell'RNA, esporre le cellule trasfette inducibili del promotore metallo-tianina a una concentrazione finale di 500 solfati di rame micromolare per 24-36 ore. Per preparare la proteina fluorescente che esprime le cellule per l'imaging, trasferire le cellule in un tubo sterile da 15 millilitri e, dopo aver contato, sedimentare le cellule mediante centrifugazione. Rimescolare il pellet in SIM riscaldata fresca di 25 gradi Celsius, integrata con 10%FBS, a una concentrazione di rame due volte 10 a 6 celle per millilitro, e trattare le cellule con ulteriore solfato di rame micromolare 500.
Quindi aggiungere da 200 a 500 microlitri di cellule a un pozzo di una camera cellulare multi-ben vivo, e posizionare la camera su uno stadio di microscopio fluorescente invertito. Mentre le cellule si sistemano nella camera, apri il software di imaging delle cellule dal vivo e fai clic su nuovo e sperimenta. Per inserire un ciclo time lapse su cui verranno scattate le immagini, fare clic sull'icona del ciclo time lapse.
Impostare l'intervallo su secondi e dividere la durata complessiva dell'esperimento desiderata in secondi per l'intervallo per impostare il numero di cicli. Lasciare che il ciclo si ripeta nel periodo di tempo totale desiderato. Per inserire un controllo dello stato attivo a infrarossi per mantenere lo stato attivo dell'obiettivo, fate clic sull'icona sposta XY e selezionate Compensazione deriva Z per aggiungere un passo di compensazione della deriva Z entro il livello del ciclo di time lapse.
Per consentire l'acquisizione di un'immagine multicanale, fate clic sull'icona del gruppo multicanale per aggiungere un livello di gruppo multicanale e fate clic sull'icona aggiungi ciclo stack Z per aggiungere un livello loop stack Z. Quindi impostare la dimensione del passo e il numero di fette desiderati e impostare l'esposizione di ogni canale sul più basso possibile per ridurre al minimo lo sbiancamento delle foto. Per immagini una divisione di celle, selezionare un obiettivo di immersione dell'olio 40 o 60 volte, e il canale di florescence mCherry, e allineare l'obiettivo lungo la parte superiore o inferiore del pozzo.
Quindi allontanati dal divisore verticale del pozzo per evitare interferenze con il gradino di compensazione della deriva Z. Individuare una cella o celle in fase G2 o M iniziale e fare clic sul pulsante visualizzazione dal vivo per iniziare a visualizzare le celle nella schermata software. Trovare cellule appropriate nella transizione da G2 a M è fondamentale per l'imaging di una divisione cellulare.
Individuare una cella con un nucleo intatto ed esattamente due centrosomi per ottenere i migliori risultati. Utilizzando la manopola di messa a fuoco fine del microscopio, concentrarsi sulle celle di interesse e fare clic su trova offset per impostare il controllo dello stato attivo a infrarossi. Fare clic sull'inizio per avviare il programma di imaging time lapse e selezionare il canale desiderato e regolare le intensità media dei pixel per regolare gli istogrammi in base alle esigenze, per visualizzare chiaramente le celle di interesse.
Controllare le celle dopo 15-20 minuti per confermare che il guasto dell'involucro nucleare si è verificato, come determinato dalla scomparsa del punto rotondo e scuro rifratta vicino al centro della cellula. Dopo altri 15-20 minuti, verificare se si è verificata l'insorgenza dell'anafase. Quindi interrompere il programma e salvare il file.
Per determinare la ripartizione dell'involucro nucleare in fase di insorgenza dell'anafase, fare clic sul pulsante frame up per determinare il tempo di rottura dell'involucro nucleare e il tempo di separazione cromosoma iniziale in minuti, e sottrarre il tempo di rottura dal tempo di insorgenza per ottenere la rottura dell'involucro nucleare al tempo di insorgenza dell'anafase per una data cellula. Quindi continuare la scansione per pre-dividere le celle per ottenere più estremità per una determinata condizione per un massimo di 12 ore dalla sedimentazione iniziale. Le cellule che stanno per dividersi possono essere prese di mira dalla presenza di due centrosomi e di un nucleo intatto, come indicato dalla luce rifratta e da una macchia più scura all'interno della cellula se viste nel canale della tubulina alfa.
La rottura dell'involucro nucleare può essere vista attraverso la scomparsa di questa macchia scura, con conseguente colorazione uniforme del citoplasma. Dopo la rottura dell'involucro nucleare, il tempo che ogni cellula impiega per formare il mandrino e per congressare e separare i cromosomi può essere misurato notando i punti di tempo di questi eventi relativi alla rottura dell'involucro nucleare. Il trattamento con RNA a doppio filamento mirato contro lo shortstop, una proteina di reticolo di microtubuli actina sospettata di influenzare la dinamica del ciclo cellulare provoca un significativo ritardo miotico.
Questo trattamento si traduce in un ritardo significativo, con molte cellule che arrestano la metafase e non vengono mai transitione all'anafase durante l'intero esperimento di imaging di due o tre ore. Il co-trattamento con RNA a doppio filamento contro il colpo e l'affare approssimativo, un componente importante di questo checkpoint, porta alla soppressione del fenotipo di arresto, con conseguente rottura dell'involucro nucleare a tempi di anafase simili alle cellule controllate e non trattate. Assicurarsi di selezionare le celle appropriate e non perdere tempo a diagnosticare le celle che non iniziano la divisione.
Se una cella non inizia a dividersi entro 20 minuti, trovare un'altra cella. I ricercatori possono seguire questa procedura per aiutare a identificare nuovi regolatori miotici, o forse nuovi composti secchi che influenzano eventi specifici nella divisione cellulare.
